應(yīng)用FRTL-5細胞建立環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性甄別方法及其干擾機制研究.pdf

1、隨著環(huán)境負荷的增加，暴露于某些環(huán)境化學(xué)物會影響機體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的增加，人類和野生動物生長發(fā)育不良效應(yīng)的增加，及不良生態(tài)效應(yīng)的增加，使環(huán)境內(nèi)分泌干擾物成為國際關(guān)注的熱點問題。環(huán)境甲狀腺激素干擾物屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。目前，還無有效可行的環(huán)境甲狀腺激素干擾物甄別方法。 FRTL-5細胞株是COON等人于1980年成功建立的一種激素依賴性的、來源于甲狀腺濾泡上皮細胞的、可幾乎無限傳代的正常細胞株。該細胞株具有攝碘和分

2、泌甲狀腺球蛋白功能，已被用于甲狀腺腫的病理研究、甲狀腺轉(zhuǎn)運碘的機制研究以及甲狀腺腫瘤發(fā)生機制等研究。本研究旨在充分利用FRTL-5細胞分泌甲狀腺球蛋白和攝碘功能，建立甄別干擾甲狀腺球蛋白合成和(或)分泌，及攝碘功能的體外甲狀腺激素干擾物甄別方法，并探索其干擾機制。 本研究分三部分： 第一部分：殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細胞毒性和增殖的影響。運用MTT法測細胞倍增時間和<'3>H摻入法分別檢測它們

3、對FRTL-5細胞倍增時間和細胞DNA合成的影響，目的是確保在本課題劑量范圍內(nèi)，殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細胞無顯著細胞毒性。細胞倍增時間結(jié)果顯示，殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈處理FRTL-5細胞后，在所設(shè)定的劑量范圍內(nèi)下測得的倍增時間分別為：對照組：41.88±2.12；殺草強組：40.34±4.54；乙烯硫脲組：41.21±2.41；五氯苯酚組：41.56±2.87;二甲戊樂靈組41.88±6.9

4、0。與對照組比均無顯著性差異。且殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈作用24小時、48小時、72小時和96小時后，均無顯著細胞毒性(p>0.05)。 <'3>H摻入法結(jié)果顯示，殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈處理組各劑量組與對照組相比，對FRTL-5細胞DNA的合成均無顯著性影響(p>0.05)。但隨著乙烯硫脲和五氯苯酚濃度的增加，F(xiàn)RTL-5細胞DNA的合成有降低的趨勢，說明它們對細胞DNA合成可能有潛在毒性。 第二部

5、分：殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細胞甲狀腺激素合成相關(guān)基因的影響。目的是探索四種受試物可能的干擾機制及其靶基因，從基因水平探索F R TL-5細胞中甲狀腺激素合成相關(guān)基因是否可用于環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性的甄別。采用RT-PCR方法檢測tg，tpo，his，tshr，ttf-1，pax-8和gapdh等基因。 結(jié)果顯示： (1)殺草強各劑量組tg基因的轉(zhuǎn)錄均顯著高于對照組，ttf-1基因僅在

6、高劑量組比對照組有顯著增強。tpo和his基因mRNA表達水平，與對照組比無顯著性差異。tshr和pax-8基因mRNA表達水平在高劑量組比對照組有顯著性降低。 (2)乙烯硫脲處理：nis基因在低、高劑量組均比對照組有顯著性降低，tpo基因在高劑量組比對照組有顯著性降低。Tg，tshr,ttf-1和pax-8基因mRNA表達水平，與對照組均無顯著性差異，tg基因有隨乙烯硫脲濃度增加，mRNA表達水平逐漸增強的趨勢，tshr和pa

7、x-8基因mRNA表達水平則有隨著乙烯硫脲濃度增加，而逐漸降低的趨勢。 (3)五氯苯酚處理：nis基因在低、高劑量組與對照組比有顯著性差異；tpo基因高劑量組比對照組有顯著降低。Tg，tshr,ttf-1和pax-8基因mRNA表達水平，與對照組均無顯著性差異。 (4)二甲戊樂靈處理：tpo基因在高劑量組表達顯著高于對照組，pax-8基因各劑量組表達均顯著高于對照組。Tg，tshr,ttf-1和nis基因mRNA表達水平

8、，與對照組比均無顯著性差異。 RT-PCR結(jié)果提示，提示四種化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性與其對甲狀腺激素合成相關(guān)基因影響有關(guān)，但四種化學(xué)物對相關(guān)基因的影響不盡相同，表明其作用機理可能有所不同。殺草強可影響tg，ttf-1，pax-8和tshr基因的mRNA表達，乙烯硫脲和五氯苯酚可能影響tpo和his基因的mRNA．表達，二甲戊樂靈可能影響tpo和pax-8基因的mRNA表達。也表明甲狀腺激素合成相關(guān)基因應(yīng)該可以作為甄別指標。

9、 第三部分：殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細胞攝碘功能和甲狀腺激素合成相關(guān)蛋白的影響。目的是利用同位素示蹤法、放免法、細胞免疫熒光法和細胞免疫化學(xué)法，從蛋白水平觀察殺草強、乙烯硫脲、五氯苯酚和二甲戊樂靈對FRTL-5細胞甲狀腺激素生物合成相關(guān)蛋白和攝碘功能的影響。探索FRTL-5細胞中甲狀腺激素合成相關(guān)蛋白和攝碘能力是否可用于環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性的甄別。 同位素示蹤法結(jié)果顯示： (1)

10、殺草強，處理12小時后，細胞總攝碘能力顯著強于對照組；處理24小時后，細胞總攝碘能力顯著低于對照組。 (2)乙烯硫脲：處理12小時后，細胞總攝碘能力顯著增強于對照組的；處理24小時后，高劑量組的細胞總攝碘能力顯著低于對照組。 (3)五氯苯酚，處理12小時后，細胞總攝碘能力顯著強于對照組；處理24小時后，與對照組的比，無顯著差異。 (4)二甲戊樂靈，處理12小時后，細胞總攝碘能力顯著強于對照組；處理24小時后，細胞

11、總攝碘能力顯著低于對照組。 放免法結(jié)果顯示，殺草強、乙烯硫脲和五氯苯酚處理的，中、高劑量組培養(yǎng)液中甲狀腺球蛋白濃度顯著低于對照組，且乙烯硫脲和五氯苯酚各劑量組之間存在劑量效應(yīng)關(guān)系。二甲戊樂靈組，中、高劑量組培養(yǎng)液中甲狀腺球蛋白濃度則顯著高于對照組。 細胞免疫化學(xué)法結(jié)果顯示，殺草強處理組，高劑量組的甲狀腺球蛋白陽性細胞積分光密度顯著低于對照組。乙烯硫脲處理組、五氯苯酚處理組和二甲戊樂靈處理組與對照組比，甲狀腺球蛋白陽性細胞

12、積分光密度值無顯著差異。 殺草強處理，各劑量組TTF-1的陽性細胞積分光密度值，與對照組比無顯著性變化。乙烯硫脲處理，各劑量組TTF-1的陽性細胞積分光密度值顯著低于對照組的。五氯苯酚處理，中、高劑量組TTF-1的陽性細胞積分光密度值顯著低于對照組。二甲戊樂靈處理組，高劑量組的TTF-1的陽性細胞積分光密度值顯著低于對照組的。 細胞免疫熒光法結(jié)果顯示，殺草強處理， TSHR的陽性細胞積分光密度值顯著低于對照組。乙烯硫脲處

13、理，低劑量組TSHR的陽性細胞積分光密度值顯著高于對照組，中劑量組TSHR的陽性細胞積分光密度值與對照組的比，無顯著性差異，高劑量組TSHR的陽性細胞積分光密度值顯著低于對照組的。五氯苯酚和二甲戊樂靈處理組各劑量組的陽性細胞積分光密度值與對照組比較無顯著性差異。 同位素示蹤法、放免法、細胞免疫熒光法和細胞免疫化學(xué)法表明，殺草強和乙烯硫脲可影響FRTL-5細胞的總攝碘能力，抑制甲狀腺球蛋白的合成和影響促甲狀腺激素受體的表達，五氯苯

14、酚和二甲戊樂靈可影響FRTL-5細胞總攝碘能力和甲狀腺球蛋白合成/分泌。本研究結(jié)果還表明，F(xiàn)RTL-5細胞的攝碘能力、合成/分泌甲狀腺球蛋白以及促甲狀腺激素受體的表達等均有可能用作甄別環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性的指標綜上所述，F(xiàn)RTL-5細胞的甲狀腺激素合成相關(guān)基因、蛋白和細胞攝碘能力等均有可能用于甄別環(huán)境化學(xué)物的甲狀腺激素干擾活性，tpo基因、nis基因、胞外TG濃度、TSGR表達水平和細胞總攝碘能力等可能有望成為甄別指標。但其靈