泌乳素對SLE患者外周血單個核細(xì)胞共刺激分子及干擾素調(diào)節(jié)因子-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 1．檢測女性SLE患者血清PRL 水平，分析其與SLE疾病活動性、臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的關(guān)系； 2．研究PRL 對SLE患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)表面共刺激信號分子CD40、CD154、CD28、CD86、CD80表達(dá)的影響，從而探討其參與狼瘡發(fā)病的機(jī)制； 3．研究在加入BRC后，SLE患者PBMC表面共刺激信號分子CD40、CD154、CD28、CD86、CD80表達(dá)變化，從而證實(shí)其治療SLE的主

2、要機(jī)制。 4．研究SLE患者中IRF-1基因的表達(dá)情況及PRL 對其的干預(yù)作用。 方法： 1．應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光儀檢測了30例女性SLE患者與20例健康人在清晨靜息狀態(tài)下的血清PRL 水平。 2．將樣本分以下幾組：①高PRL 的SLE患者組(N=18)；②正常 PRL 的SLE患者組(N=12)；③正常對照組(N=20)；④正常PRL的SLE患者組+rhPRL；⑤正常對照組+rhPRL；⑥高PRL的SLE患者

3、組+BRC；⑦正常PRL 的 SLE患者組+rhPRL+BRC。取十二孔板，使每孔細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5×10<'6>/ml。根據(jù)文獻(xiàn)資料得出：rhPRL的最適濃度為10ng/ml，BRC的最適濃度為2μg/ml。 3．刺激培養(yǎng)：PBMC分離、培養(yǎng)：按密度梯度離心法分離外周血中的PBMC，步驟如下：(1)在12ml有刻度無菌離心管中，每管加入4mlFicoll淋巴細(xì)胞分離液一取肝素抗凝的外周靜脈血10ml(包括30例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和

4、20例正常對照女性)與等量PBS充分混勻稀釋，用巴斯德滴管吸取5ml的抗凝血(抗凝血用等量的PBS稀釋)沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上(每樣本按4管分離)，20℃，2000rpm水平離心20min；(2)用毛細(xì)胞吸管插到灰白色層，吸取單個核細(xì)胞，置于另一離心管內(nèi)，加入5倍以上體積的PBS，20℃，1500rpm水平離心10min，洗滌細(xì)胞一次，獲得研究樣品的PBMC。(3)處理后的每組細(xì)胞放入37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h

5、后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。4．流式細(xì)胞儀檢測：取培養(yǎng)細(xì)胞每組分為5管，1×10<'6>個細(xì)胞/管，以PBS洗2次后分5管依次加入抗CD40、CD154、CD28、CD80、CD86單抗各18ul，并另設(shè)2管同型對照Mouse IgGl FITC、Mouse IgGl PE各18ul，4℃、避光孵育30min，以PBS洗2次后加入300ul 1％多聚甲醛固定待檢。上機(jī)前先用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀器變異系數(shù)在2.0％以內(nèi)，上機(jī)后收集10000個細(xì)胞熒

6、光強(qiáng)度以對數(shù)放大，測定光閃射數(shù)據(jù)，計(jì)算表達(dá)CD40、CD154、CD28、CD80、CD86的細(xì)胞數(shù)，得出陽性熒光細(xì)胞百分率。 5．應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)結(jié)合凝膠圖象掃描技術(shù)檢測IRF-1基因的表達(dá)情況。以β—actin基因的表達(dá)量為對照，將IRF-1擴(kuò)增產(chǎn)物掃描值與β—actin擴(kuò)增產(chǎn)物掃描值的比值作為IRF-1基因表達(dá)的相對值進(jìn)行相對定量分析。 結(jié)果： 1．SLE患者血清平均PRL 水平明

7、顯高于正常對照組，且活動期更為明顯。SLE患者血清PRL 水平與SLEDAI正相關(guān)。 2．高PRL 的SLE患者腎損害、抗ds-DNA抗體陽性、補(bǔ)體C3、C4下降的發(fā)生率明顯高于血清PRL 正常者，而皮疹、關(guān)節(jié)炎、漿膜炎及血液系統(tǒng)受累的發(fā)生率則無明顯差異。 3．①高PRL 的SLE患者組PBMC表面CD154的表達(dá)水平顯著高于正常PRL的SLE患者組和正常對照組；而正常PRL的SLE患者與正常對照組間CD154的表達(dá)水平

8、無顯著差異。 ②高PRL的SLE患者組、正常PRL 的SLE患者組PBMC表面CD86的表達(dá)水平均顯著高于正常對照組，但高PRL 的SLE患者組和正常PRL的SLE患者組CD86的表達(dá)水平相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ③高PRL的SLE患者組、正常PRL，的SLE患者組PBMC表面CD40、CD28、CD80的表達(dá)水平和正常對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4．①經(jīng)rhPRL刺激后，正常PRL 的SLE患者PBMC上CD154表達(dá)水平

9、顯著高于刺激前。 ②而經(jīng)rhPRL刺激前后，正常對照組CD154表達(dá)水平與刺激前無明顯差異。 5．①高PRL 的SLE患者組PBMC加BRC共同培養(yǎng)后CD154表達(dá)水平與加BRC前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ②正常PRL 的SLE患者+rhPRL 組在加BRC共同培養(yǎng)后，其PBMC表面CD154表達(dá)水平與加BRC前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 6．①30例SLE患者和20例正常對照組均檢測到特異性IRF-1和β-actin

10、基因片段，其中SLE患者組 IRF-1/β—actin比值為0.89±0.21，其中高PRL的SLE患者為1.06±0.26，正常PRL 的 SLE患者為0.82±0.21，而正常對照組為0.78±0.18。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SLE患者組IRF—1基因表達(dá)的相對值顯著高于正常對照組；高 PRL 的SLE患者組顯著高于正常PRL 的SLE 患者組；而正常PRL的SLE患者組與正常對照組間無顯著差異。 ②經(jīng)rhPRL 刺激后，正常PRL

11、 的SLE患者IRF-1基因表達(dá)的相對值為0.99±0.22，顯著高于rhPRL 刺激前。 ③經(jīng)rhPRL 刺激后，正常對照組IRF-1基因表達(dá)的相對值為0.79±0.18，與刺激前相比無顯著差異。 結(jié)論： 1．PRL 在SLE的發(fā)病機(jī)制中可能起到一定的作用，其水平升高與病情活動明顯相關(guān)，可作為判定SLE疾病活動的指標(biāo)之一。 2．PRL 可上調(diào)SLE患者PBMC表面CD154的表達(dá)，從而可以推測PRL在S

12、LE中的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過與PBMC表面的PRLR結(jié)合，PRL-PRLR復(fù)合物內(nèi)在化，增加共刺激信號分子CD154的表達(dá)而引發(fā)的。 3．在SLE中，高PRL 與 CD86的高表達(dá)間無因果關(guān)系，表明PRL 并非通過CD28/B7這條通路而參與SLE的發(fā)病。4．BRC未下調(diào)內(nèi)源性PRL或外源性PRL(rhPRL)所誘導(dǎo)的CD154表達(dá)水平，證實(shí)了BRC治療SLE的主要機(jī)制可能是抑制垂體分泌PRL，從而降低血清PRL 水平以達(dá)治療