CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)急性白血病患者化療療效、預(yù)后意義的研究.pdf

1、迄今為止，化療仍是急性白血病的主要治療手段，但每一個(gè)體接受標(biāo)準(zhǔn)劑量藥物治療時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)，往往存在著極大的個(gè)體差異，有些會(huì)出現(xiàn)耐藥，有些會(huì)出現(xiàn)難以耐受的毒副反應(yīng)。這在臨床上是一個(gè)非常重要的問(wèn)題，它可以導(dǎo)致治療失敗，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的藥物毒副作用。其中涉及的因素很多，藥物代謝酶是最關(guān)鍵的一環(huán)，它是介導(dǎo)機(jī)體藥物代謝活化與代謝解毒之間平衡的關(guān)鍵物質(zhì)，代謝酶在基因編碼上的多態(tài)性可以影響藥物的效率和毒性。 細(xì)胞色素P450酶系（CYPs）的3A

2、亞家族，參與約60％的處方藥，是機(jī)體最重要的藥物代謝酶。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AL細(xì)胞株僅轉(zhuǎn)錄CYP3A亞家族成員CYP3A5，其表達(dá)及活性有著很大的個(gè)體和種族間差異，被認(rèn)為是個(gè)體間CYP3A 活性差異(相差約10～40 倍)的最主要因素，從而造成所代謝的藥物療效、毒性的個(gè)體間差異。CYP3A5多態(tài)性主要是由單核苷酸的多態(tài)性(SNPs) 造成，CYP3A5*3(6986A>G)突變是其中最重要的一個(gè)。所以，本課題著重研究CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)

3、白血病患者化療療效、預(yù)后意義的研究。 第一部分AL患者CYP3A5的3號(hào)內(nèi)含子序列測(cè)定 ①采用PCR-RFLP的方法，檢測(cè)88例AL患者白血病細(xì)胞DNA的CYP3A5第3個(gè)內(nèi)含子中的已知點(diǎn)突變A→G(CYP3A5*3)，并依據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行基因分型。 ② 88例樣本中，共檢出野生型純合子（CYP3A5*1/*1）23例（26％）；雜合子（CYP3A5*1/*3）44例（50％）；突變型純合子（CYP3A5*3/*3

4、）21例（24％）。三組間年齡、外周血WBC計(jì)數(shù)、外周血和骨髓原幼稚細(xì)胞比例等臨床資料，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ③ 88例患者中位隨訪期為11.8±1.7個(gè)月(1~115)。野生型純合子、雜合子、突變型純合子三組，DFS（月）分別為7.5±1.8、27±15.8、52.3±8.1； OS（月）分別為11.6±2.1、30.5±12.2、52.3±8.5。除野生型組與突變純合子組的復(fù)發(fā)率相比P>0.1外，余各組間P值均<0.05，有統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義。 ④隨訪期間，無(wú)復(fù)發(fā)者為敏感組（36例），有復(fù)發(fā)且難治者為繼發(fā)耐藥組（30例），從未達(dá)緩解者為原發(fā)耐藥組（22例）。單因素分析與耐藥的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，年齡、發(fā)病時(shí)WBC計(jì)數(shù)、FAB分類、染色體、CYP3A5基因型，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而影響生存期。而性別、發(fā)病時(shí)外周血和骨髓原始幼稚細(xì)胞的比例分組間則差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多因素分析，年齡、FAB分類、CYP3A5基因型與耐藥密切相關(guān)。 第二部分CYP3A5在AL

6、患者骨髓組織中的表達(dá)水平測(cè)定 ①應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)生物素放大技術(shù)，檢測(cè)88例患者骨髓活檢病理標(biāo)本CYP3A5蛋白的表達(dá)情況，一抗、二抗分別為兔抗人CYP3A5多抗，生物素化羊抗兔IgG。 ②88例患者骨髓原始細(xì)胞CYP3A5陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中位值為0.137（0~0.6）。 ③野生型純合子、雜合子、突變型純合子三組，檢測(cè)結(jié)果分別為：0.366±0.040、0.066±0.089、0.005±0.002，與野生型組相

7、比，P值分別為0.002和0.000。提示含CYP3A5*3基因型的患者CYP3A5表達(dá)明顯降低。 ④按耐藥情況分組，原發(fā)耐藥組、繼發(fā)耐藥組、敏感組三組的CYP3A5表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分別為：0.220±0.049、0.119±0.030、0.008±0.025，與敏感組相比，P值分別為0.008、0.356。即敏感組和原發(fā)耐藥組CYP3A5表達(dá)率相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ⑤按年齡、性別、發(fā)病時(shí)WBC計(jì)數(shù)、外周血和骨髓原始幼稚細(xì)

8、胞、染色體資料分組，各組間CYP3A5表達(dá)率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第三部分HPLC法檢測(cè)AL患者骨髓原代細(xì)胞CYP3A5酶的活性 ①利用CYP3A5可將底物氫化考的松(HC)特異性地代謝為產(chǎn)物6β-羥氫化考的松(6β-OHC)這一催化特性，應(yīng)用HPLC方法檢測(cè)88例AL患者白血病細(xì)胞CYP3A5酶活性(以6β-OHC/HC值代表)。 ② HPLC質(zhì)控參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線：6β-OHC出峰時(shí)間9.5min、HC出峰時(shí)間14.

9、8 min、Dex出峰時(shí)間16.6min。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C = 0.1080 + 0.02455A ( r =0.9997, n =6)。 ③ 88例患者6β-OHC/HC值均數(shù)為0.142±0.083（0.007~1.874），每個(gè)病例標(biāo)本試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，所有病例標(biāo)準(zhǔn)差范圍在0.0006~0.0272之間，標(biāo)本測(cè)定穩(wěn)定性好，結(jié)果可信。 ④野生型純合子、雜合子、突變型純合子三組，6β-OHC/HC值分別為：

10、 1.344±0.0272、0.120±0.067、0.014±0.0012。野生型純合子組與雜合子組、突變型純合子組，原代細(xì)胞6β-OHC/HC值相比，P值分別為0.000、0.000，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 ⑤原發(fā)耐藥組、繼發(fā)耐藥組、敏感組三組，檢測(cè)6β-OHC/HC值分別為：0.108±0.0310、0.046±0.0214、0.023±0.0051，與敏感組相比，P值為0.061、0.022。敏感組與原發(fā)耐藥組兩組差異具有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義。 小結(jié): CYP3A5在AL原代細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄，并存在CYP3A5*3單核苷酸多態(tài)性。AL患者CYP3A5*3基因型頻率與健康人群相似，提示CYP3A5*3突變可能與AL發(fā)病率無(wú)關(guān)。CYP3A5*1基因型與耐藥相關(guān)，提示AL細(xì)胞中可能存在CYP3A5對(duì)化療藥的局部代謝滅活。AL患者的原代白血病細(xì)胞表達(dá)CYP3A5蛋白，且存在極大的個(gè)體間差異，初治時(shí)CYP3A5陽(yáng)性率與原發(fā)耐藥顯著相關(guān)。HPLC方法證實(shí)AL細(xì)胞具有

12、CYP3A5代謝活性，并與骨髓原始細(xì)胞CYP3A5陽(yáng)性率成正比。故初治時(shí)骨髓原始細(xì)胞CYP3A5陽(yáng)性率可作為AL療效與預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。 創(chuàng)新性： ①第二部分為創(chuàng)新性研究，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)CYP3A5基因表達(dá)（包括CYP家族）與腫瘤患者化療療效及預(yù)后之間相關(guān)性的研究，研究證實(shí)了AL患者初治時(shí)CYP3A5陽(yáng)性率是化療療效及預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，有助于更好地理解腫瘤患者化療療效的個(gè)體差異，并具有臨床應(yīng)用價(jià)值。 ②第一部

13、分檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AL患者白血病細(xì)胞CYP3A5*3基因頻率與健康人群相似，提示CYP3A5*3突變可能與AL發(fā)病無(wú)關(guān)。 ③第三部分借鑒了國(guó)外學(xué)者檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞株體外培養(yǎng)條件下CYP3A5活性的方法，并予以改良，建立了適用于AL細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的CYP3A5活性檢測(cè)方法，可用于研究AL細(xì)胞株、AL患者原代細(xì)胞CYP3A5的基礎(chǔ)活性及藥物對(duì)活性的調(diào)控，為闡明白血病細(xì)胞局部藥物代謝活性、局部藥物-藥物相互作用，進(jìn)而實(shí)施個(gè)體化治療提供技術(shù)平