cDNA基因芯片和反義核柑酸技術(shù)篩選及證實(shí)GTD發(fā)病相關(guān)基因.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文cDNA基因芯片和反義核柑酸技術(shù)篩選及證實(shí)GTD發(fā)病相關(guān)基因姓名：崔金全申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科（婦科腫瘤）指導(dǎo)教師：石一復(fù)20040101新江大學(xué)博士生學(xué)位論文有關(guān)的基因上調(diào)。第二部分芯片結(jié)果驗(yàn)證及滋養(yǎng)細(xì)胞增生機(jī)制探討方法：利用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)研究手段免疫組織化學(xué)、免疫印跡及RTPCR，對(duì)基因芯片證實(shí)葡萄胎和絨毛膜癌細(xì)胞中高表達(dá)的核苷酸還原酶小亞單位(RRM2)、胸腺嘧啶核苷激酶I(TKl)、復(fù)制因子C小亞單

2、位2(RFC2)、CyclinBl基因，在15例正常絨毛、20例新鮮葡萄胎組織、98例存檔石蠟包埋滋養(yǎng)細(xì)胞疾病組織及JAR、JEG3絨癌細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行較為詳盡的檢測(cè)。PCNA在98例存檔石蠟包埋滋養(yǎng)細(xì)胞疾病組織的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果：JAR、JEG一3細(xì)胞、葡萄胎組織RRM2、TKlmRNA和蛋白水平顯著高于正常原代滋養(yǎng)細(xì)胞或正常絨毛組織，RFC2在JAR、JEG3細(xì)胞、葡萄胎中蛋白的表達(dá)顯著高于正常絨毛和正常原代滋養(yǎng)細(xì)胞。Cy

3、clinB1蛋白在JAR、JEG3細(xì)胞、葡萄胎組織表達(dá)增加。五項(xiàng)指標(biāo)在石蠟包埋GTD組織中的表達(dá)顯著高于正常絨毛，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤未化療者TKl、CyclinBl、PCNA表達(dá)顯著高于葡萄胎，葡萄胎惡變者RRM2、TKl、PCNA、CyelinBl表達(dá)顯著高于自然恢復(fù)者，化療影響TKl、RFC2、CyclinB1表達(dá)，期別增加RRM2、TKl、RFC2表達(dá)增強(qiáng)，WHO預(yù)后評(píng)分越高RRM2、TKl、RFC2、CyclinBl表達(dá)越強(qiáng)，PC

4、NA與CyelinB1、TKl的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。第三部分RR92反義寡核苷酸對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞株體外生長影響方法：以脂質(zhì)體(Oligofectamine)為載體，將人工合成的分別位于RRM2mRNA核苷酸序列626—645(編碼區(qū))和15721591(3’端非編碼區(qū))位點(diǎn)且全程硫代修飾的兩條反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，ASODN)片斷導(dǎo)入絨毛膜癌JAR細(xì)胞中，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞成活率，免疫印

5、跡和RTPCR方法檢測(cè)ASODN對(duì)RRM2蛋白和mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：RRM2編碼區(qū)的ASODN(ASODNl)以量效和時(shí)效形式顯著抑制JAR細(xì)胞增殖，以時(shí)效形式降調(diào)RRM2的表達(dá)。3’端非編碼區(qū)ASODN(ASODN2)對(duì)細(xì)胞增殖及RRM2表達(dá)無明顯的影響，但與ASODNl聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用和對(duì)RRM2表達(dá)的影響顯著加強(qiáng)。ASODNl作用12ll，RRM2表達(dá)水平開始下降；作用24h，細(xì)胞RRM2表達(dá)和生長顯著抑制，4