半夏體細胞培養(yǎng)體系的構(gòu)建.pdf

1、本研究采用莖尖培養(yǎng)獲得的半夏試管苗為試材，分別進行了半夏葉的組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體分離及活力檢測的研究，獲得以下研究結(jié)果，為半夏的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化提供了一個技術(shù)平臺：1.半夏組織培養(yǎng)的研究：為了選出誘導(dǎo)半夏愈傷組織和小珠芽的最佳外植體，分別切取半夏無菌苗的葉片、葉柄上部和葉柄基部，接種在MS+1.0mg/LBA+0.02mg/LNAA固體培養(yǎng)基上。結(jié)果顯示：1)在添加1.0mg/L6-BA和0.02mg/LNAA組合的培養(yǎng)基上，半夏葉

2、不同部位誘導(dǎo)愈傷組織，以葉柄上部和葉柄基部的誘導(dǎo)效果較好，均為100.0﹪；而葉片則較差，僅為68.75﹪。2)不同的外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織有不同的分化率，其中葉柄基部的分化率最高，達45.3﹪；葉柄上部的分化率為32.8﹪；而葉片則沒有誘導(dǎo)出小珠芽。3)從重量計算，葉不同部位外植體的生長率分別為：葉片：21.7倍；葉柄上部：77.6倍；葉柄基部：85.2倍。綜合上述結(jié)果，可以認為：半夏的葉柄基部是誘導(dǎo)小珠芽和愈傷組織的最佳外植體。

3、 2.半夏細胞培養(yǎng)的研究：為獲得均勻一致的半夏愈傷顆粒，從而建立穩(wěn)定的細胞懸浮培養(yǎng)體系，按L9(34)表正交安排試驗，A、B、C、D4個考察因素即2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、激動素(KT)各取三個水平，以半夏無菌苗的葉片、葉柄為研究材料，培養(yǎng)在附加上述生長素和細胞分裂素不同配比的液體培養(yǎng)基中。正交試驗結(jié)果顯示：1)就半夏葉片懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織這一指標(biāo)來看，4種激素對愈傷組織

4、誘導(dǎo)率的影響從大到小依次6-BA，2，4-D，KT和NAA，誘導(dǎo)葉片愈傷組織的最佳條件為A2B1C2D3，即MS+2，4-D0.5mg/L+6-BA0.2mg/L+KT0.5mg/L；2)半夏葉片愈傷組織形成后，為了能夠得到均勻一致的愈傷顆粒(顯微鏡下觀察這些愈傷組織均是由分生細胞構(gòu)成)，從而建立穩(wěn)定的懸浮細胞培養(yǎng)體系，4種激素對愈傷組織生長的影響從大到小依次6-BA，NAA，2，4-D和KT，適合愈傷生長的最佳激素配比是A1B2C2D

5、2，即MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.2mg/L+KT0.2mg/L；綜合以上結(jié)果，可以得出：將在液體培養(yǎng)基A2BiC2D3中誘導(dǎo)出的愈傷組織，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基A1B2C2D2中繼續(xù)培養(yǎng)，就能快速得到均勻一致的愈傷顆粒，為半夏的工廠化生產(chǎn)提供材料;3)在半夏葉柄的懸浮培養(yǎng)過程中，葉柄變化沒有葉片變化顯著，而且沒有愈傷顆粒。 3.半夏原生質(zhì)體的分離及活力檢測的研究：為了獲得半夏遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，因此，進行半夏葉肉的原生質(zhì)體

6、分離。以半夏葉片為分離材料，在1﹪纖維素酶(CellulaseR-10)+1﹪離析酶(MacerozymeR-10)+0.1﹪果膠酶Y23(PectolyaseY23)的酶溶液中分別加入甘露醇和山梨醇這兩種滲透壓調(diào)節(jié)劑，計算原生質(zhì)體的得率及活力。結(jié)果顯示：半夏葉在1﹪纖維素酶(CellulaseR-10)+1﹪離析酶(MacerozymeR-10)+0.1﹪果膠酶Y23(PectolyaseY23)+0.55M山梨醇+100mMCaCl