三氧化二砷對急性早幼粒細胞白血病NB4細胞株Warburg效應的影響和機制.pdf

1、第一部分白血病細胞株中Warburg效應的探討
　　目的:檢測白血病細胞株中是否存在Warburg效應。
　　方法:糖酵解抑制劑(2-DG)和氧化磷酸化抑制劑(oligomycinA:OA)分別作用于THP-1、K562、HL-60和NB4細胞株48h,采用MTT檢測細胞的生長抑制率。乳酸測定試劑盒和葡萄糖測定試劑盒測定各細胞株在低血清的RPMI1640中葡糖糖的消耗和乳酸生成,及其兩者的比值。
　　結(jié)果:白血病細胞株

2、的生長抑制對2-DG呈濃度依賴性,不同濃度的2-DG干預48h后發(fā)現(xiàn)NB4和HL-60細胞的生長抑制較明顯,K562對2-DG作用不敏感。白血病細胞株的生長抑制對OA不成濃度依賴性,OA作用后48h后發(fā)現(xiàn)THP-1對OA敏感性較高,K562和NB4對OA敏感性較低。NB4對葡糖糖的攝取較其它細胞株更顯著,且消耗的葡萄糖/生成的乳酸比值≈1/2。
　　結(jié)論:NB4對糖酵解的抑制劑作用最敏感,且消耗的葡萄糖/生成的乳酸比值≈1/2,提

3、示NB4的Warburg效應異常顯著。
　　第二部分三氧化二砷在NB4中對miRNA-122的調(diào)節(jié)作用
　　目的:檢測三氧化二砷和全反式維甲酸作用于急性早幼粒細胞白血病細胞系NB4細胞后miRNA-122的表達變化。
　　方法:采用實時定量PCR檢測藥物干預前后miRNA-122的表達。
　　結(jié)果:1μmol/LATO和1μmol/L的ATRA作用于NB448h,實時定量PCR檢測結(jié)果表明,ATO作用后miRNA

4、-122的表達增高了4倍,ATRA作用后miRNA-122表達增高了1.2倍。
　　結(jié)論:相同藥物濃度作用下,ATO更能促進miRNA-122的表達。
　　第三部分PKM2是miRNA-122靶基因
　　目的:證實PKM2為miRNA-122靶基因,抑制miR-122能夠解除對PKM2的負調(diào)控導致PKM2表達升高。
　　方法:采用TargetScanHuman5.1軟件預測miRNA-122和PKM2的結(jié)合位點,

5、設計調(diào)取PKM23’UTR的引物序列和野生突變PKM23’UTR并擴增,將擴增的序列和psiCHECK-2載體連接并轉(zhuǎn)化,采用陽離子脂質(zhì)體法對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和miR-122模擬物、抑制劑和陰性對照分別共轉(zhuǎn)染NB448小時后收集細胞,采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對熒光素酶的活性進行檢測。構(gòu)建攜帶miR-122inhibitor的慢病毒并轉(zhuǎn)染NB4細胞,用G418篩選穩(wěn)定表達的NB4-mir-122inhibitor和NB4-NCinhititor細胞

6、系,并利用實時定量PCR檢測miR-122的表達。采用MTS和WesternBlot檢測抑制miR-122表達后細胞PKM2的表達以及細胞的增殖能力。
　　結(jié)果:PKM23’UTR質(zhì)粒與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降有顯著差異,mutPKM23’UTR-1質(zhì)粒與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降無統(tǒng)計學差異,mutPKM23’UTR-2與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降有顯著差異,mutPKM23’UTR-3(同

7、時突變兩個預測結(jié)合位點)與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降無統(tǒng)計學差異。成功構(gòu)建并篩選出NB4-mir-122inhibitor和NB4-NCinhititor細胞系,通過檢測發(fā)現(xiàn)抑制miR-122表達后細胞PKM2的表達升高,細胞的增殖能力增強。
　　結(jié)論:實驗通過雙熒光素酶和蛋白水平證實PKM2是miRNA-122特異的靶基因,PKM2和miRNA-122兩處結(jié)合位點中,第一處結(jié)合位點起關(guān)鍵作用,第二處結(jié)合位點起協(xié)助作用