喹硫平抑制破骨細(xì)胞分化的作用觀察及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　進(jìn)展期乳腺癌、肺癌及前列腺癌等惡性腫瘤具有發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的傾向。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨組織后可直接或間接激活破骨細(xì)胞并導(dǎo)致骨組織破壞，進(jìn)一步引發(fā)頑固性疼痛、神經(jīng)壓迫癥狀、病理性骨折及高鈣血癥等并發(fā)癥的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生存及生活質(zhì)量。與其他組織不同，骨組織主要由較為堅(jiān)硬的礦物質(zhì)構(gòu)成，骨組織對(duì)于腫瘤的侵襲應(yīng)具有更強(qiáng)的抗性。目前認(rèn)為:腫瘤骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨損傷并非由腫瘤細(xì)胞直接引起而是由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收導(dǎo)致的。為了破壞骨組織，腫瘤

2、細(xì)胞必須具有激活破骨細(xì)胞的相關(guān)特性，進(jìn)而導(dǎo)致骨組織的損傷。大量研究表明:腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)釋放PTHrP、IL-1、IL-6和IL-11等因子作用于成骨細(xì)胞產(chǎn)生核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)。RANKL目前被認(rèn)為是刺激破骨細(xì)胞活化最主要、最有效的刺激因子。
　　破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞，是骨吸收的效應(yīng)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至骨組織引發(fā)的溶骨性損傷與其對(duì)破

3、骨細(xì)胞的激活能力密切相關(guān)。因此，抑制破骨細(xì)胞分化的藥物能夠有效防止腫瘤骨轉(zhuǎn)移引發(fā)的溶骨性骨損傷及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。目前，臨床上用于抗骨損傷的藥物主要包括雙磷酸鹽類藥物、激素類藥物及RANKL單克隆抗體等。盡管上述藥物對(duì)于溶骨性骨損傷的治療均具有一定的療效，但這些藥物的應(yīng)用都存在一定的局限性及副作用的發(fā)生，如骨壞死、骨肉瘤發(fā)生、栓塞及食管刺激等。因此，尋求能夠更為安全、有效地用于治療腫瘤骨轉(zhuǎn)移等疾病引發(fā)骨損傷的藥物成為近些年關(guān)注及研究的熱

4、點(diǎn)。
　　喹硫平(Quetiapine，QUE)是經(jīng)FDA認(rèn)證的非典型抗精神病藥物。課題組前期研究發(fā)現(xiàn):QUE能夠通過(guò)作用于MAPK通路促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，同時(shí)有研究表明:QUE對(duì)NF-κB通路也具有一定的調(diào)控作用，而MAPK和NF-κB通路均是破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵通路。于是我們嘗試驗(yàn)證QUE能否通過(guò)抑制MAPK和NF-κB通路抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，以及保護(hù)腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移引發(fā)的溶

5、骨性骨損傷。期望通過(guò)本研究為腫瘤骨轉(zhuǎn)移等溶骨性疾病的治療提供新的藥物選擇和治療策略。
　　目的:
　　1.利用RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(Bonemarrow-derived macrophages，BMMs)向破骨細(xì)胞分化模型，體外觀察非典型抗精神病藥物QUE對(duì)破骨細(xì)胞分化是否具有抑制作用。
　　2.利用腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，在體進(jìn)一步驗(yàn)證QUE能否抑制腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化并起

6、到骨保護(hù)作用。
　　3.利用RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化模型，對(duì)QUE抑制破骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法:
　　1.選用目前使用較多的DMEM和α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，觀察上述培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖、存活的影響，從而選擇適合培養(yǎng)基用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。用10、30、50、100、200ng/ml濃度RANKL重組蛋白作用于RAW264.7細(xì)胞，遴選用于促進(jìn)破

7、骨細(xì)胞分化的最佳RANKL使用濃度。
　　2.分別利用差速貼壁法、梯度離心法等方法獲取BMMs，并使用不同濃度RANKL和M-CSF重組蛋白作用于BMMs，選擇最優(yōu)的細(xì)胞獲取方法和適宜的細(xì)胞因子使用濃度。
　　3.使用不同濃度QUE(1μM、10μM、25μM、50μM、100μM)作用于RAW264.7細(xì)胞并培養(yǎng)48小時(shí)，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，選擇適合的QUE藥物使用濃度。利用前期建立的RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化模

8、型，觀察QUE對(duì)破骨細(xì)胞分化是否具有抑制作用。使用不同濃度QUE(1μM、10μM、25μM、50μM)作用于RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化模型，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)QUE對(duì)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響。
　　4.RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，分別于培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天和第4天加入QUE，觀察QUE抑制破骨細(xì)胞分化的有效作用時(shí)期。
　　5.購(gòu)買商品化免疫缺陷小鼠，脛骨髓腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞注射法構(gòu)建人類

9、乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。給予QUE(10mg/kg/d)腹腔注射處理6周，X線檢測(cè)QUE對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移引發(fā)骨損傷的保護(hù)作用，HE和TRAP染色觀察腫瘤細(xì)胞侵襲情況及QUE對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移引發(fā)破骨細(xì)胞活化的抑制作用。
　　6.利用RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化模型，采用western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法觀察QUE對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程中MAPK和NF-κB等通路的作用情況。
　　結(jié)果

10、:
　　1.相比于α-MEM培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基更有利于RAW264.7細(xì)胞的增殖、存活及形態(tài)的維持。使用不同濃度的RANKL重組蛋白作用于RAW264.7細(xì)胞，當(dāng)濃度低于30ng/ml時(shí)，RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化作用比較有限。但當(dāng)濃度高于50ng/ml時(shí)，RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用明顯增強(qiáng)，且50ng/ml到200ng/ml之間差異不明顯。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)RANKL(50ng/ml)誘導(dǎo)分化5天后，經(jīng)TRAP染色

11、可見(jiàn)大量TRAP陽(yáng)性多核破骨樣細(xì)胞形成。
　　2.相比于梯度離心法和磁珠分選法，差速貼壁法簡(jiǎn)單、易行，通過(guò)該方法分離得到的BMMs細(xì)胞經(jīng)RANKL和M-CSF共同誘導(dǎo)7天后可最終分化為TRAP陽(yáng)性的多核破骨樣細(xì)胞。當(dāng)RANKL濃度為50ng/ml、M-CSF濃度為25ng/ml時(shí)，其對(duì)BMMs向破骨細(xì)胞分化具有較好的促進(jìn)作用。
　　3.經(jīng)CCK-8檢測(cè)，1μM到50μM濃度QUE對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性作用。用50

12、μM濃度的QUE分別作用于RAW264.7細(xì)胞3天、5天，作用于BMMs細(xì)胞3天、5天和7天，50μM濃度QUE對(duì)上述細(xì)胞的增殖均沒(méi)有顯著影響。
　　4.相比于陽(yáng)性對(duì)照組，1μM和10μM濃度QUE對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化無(wú)顯著影響，但當(dāng)濃度為25μM和50μM時(shí)，QUE能夠顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化。用50μM濃度QUE作用于RANKL和M-CSF共同誘導(dǎo)的BMMs向破骨細(xì)胞分化模型，7天

13、后對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn):50μM濃度QUE同樣能夠有效抑制BMMs向破骨細(xì)胞的分化。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):25μM和50μM濃度QUE可以有效抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程中破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　5.RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化模型中，當(dāng)?shù)?天和第2天加入50μM濃度QUE時(shí)，QUE能夠有效抑制破骨細(xì)胞的分化，而在分化后期（第3天、第4天）加入QUE則抑制破骨細(xì)胞分化作用不明顯。
　

14、　6.QUE處理乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型6周后，X線檢測(cè)結(jié)果提示:QUE能夠明顯減輕腫瘤骨轉(zhuǎn)移引發(fā)的骨損傷，起到骨保護(hù)作用;HE及TRAP染色結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均可見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞侵襲。與對(duì)照組相比，QUE處理組腫瘤侵襲區(qū)域與正常骨組織交界處破骨細(xì)胞的激活數(shù)量明顯減少。
　　7.Western blot檢測(cè)QUE對(duì)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中MAPK通路的作用。結(jié)果表明:QUE對(duì)p38、ERK和JNK的磷酸化都有明顯的抑制作用。
　　

15、8.RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化模型中，在RANKL作用下的NF-κB通路中IκBα的降解明顯，而QUE可明顯抑制IκBα降解的發(fā)生，并同時(shí)抑制p65的磷酸化水平。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:在15到60分鐘時(shí)間段內(nèi)RANKL可以促進(jìn)p65的漿核轉(zhuǎn)移，而加入QUE處理后可明顯抑制漿核轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞和BMMs向破骨細(xì)胞分化模型，為后續(xù)觀察QUE對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用及相關(guān)

16、機(jī)制研究打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.在RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化模型以及RANKL和M-CSF共同誘導(dǎo)的BMMs向破骨細(xì)胞分化模型中，QUE均能夠明顯抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化，并能夠抑制破骨細(xì)胞分化過(guò)程中相關(guān)mRNA的表達(dá)。
　　3.QUE對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用主要作用于破骨細(xì)胞分化的早期階段。
　　4.人類乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型中，QUE能夠明