端粒酶及TERT在實驗性小鼠CVB3心肌炎的作用及黃芪甲甙干預研究.pdf

1、第一部分柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠循環(huán)血及心肌內(nèi)端粒酶和干細胞的時空變化的研究 目的：病毒性心肌炎引起的心肌損傷作用機制并未完全清楚。本研究通過柯薩奇B3病毒性心肌炎實驗模型，觀察柯薩奇B3病毒性心肌炎循環(huán)血及心肌內(nèi)端粒酶活性及TERT和干細胞時空變化特征，探討其在病毒性心肌炎發(fā)病機制中的可能作用。 方法：小鼠隨機接受病毒培養(yǎng)基(對照組，CON組)或病毒液(病毒組，VIR組)注射。隨后，動物根據(jù)以下幾時間點進一步分為六小

2、組：注射后1天、3天、7天、14天、21天和28天。另取10只正常小鼠作正常對照組(NOR組)。從動物眼球取血分離得到循環(huán)血單個核細胞，應用流式細胞儀分析其干細胞標記、TaqMan實時定量RT—PCR、免疫印跡技術和TRAP—ELISA法分別用來測定心肌內(nèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)mRNA和蛋白水平變化以及端粒酶活性變化情況。利用H&E染色、組織學及免疫熒光染色技術觀察心肌炎癥反應、干細胞標記物及粒細胞過氧化酶(MPO)和活性氧(ROS

3、)變化。 結果：1．MPO和ROS含量于感染后3天達高峰，感染后28天，基本回到正常水平。CON組與NOR組之間，MPO和ROS含量無顯著性差異(p＞0.05)。 2．與正常組比較，對照組各時段小鼠循環(huán)血CD44+CD106+干細胞(間充質(zhì)干細胞標記物)和Sca—1+CD45+干細胞(造血干細胞)無顯著性差異(p＞0.05)。而病毒組，循環(huán)血CD44+CD106+間充質(zhì)干細胞含量于感染后3天達高峰，7天下降，而于14天基

4、本恢復正常水平。同時，循環(huán)血Sca—1+CD45+造血干細胞含量于感染后1天開始增加，并持續(xù)至感染后14天。 3．心臟中Sca—1抗體染色陽性細胞數(shù)于感染后3天明顯增加，7天達高峰，14天仍保持不變，而28天明顯減少。各對照組之間局部心臟干細胞數(shù)量無明顯變化。 4．與NOR組和CON組比較，病毒組小鼠端粒酶表達明顯下降(p＜0.05)。病毒組TERTmRNA表達水平和蛋白表達水平于感染后7天和14天明顯增高，于21天下降

5、。端粒酶活性也在感染后7天和14天明顯增高。而NOR組和CON組各時段TERT表達水平和端粒酶活性無顯著性改變(p＞0.05)。 5．感染后14天心肌細胞內(nèi)和血管內(nèi)皮細胞TERT陽性染色密度明顯多于感染后3天，但兩者均明顯少于正常組(p＜0.05)。 結論：本研究結果表明病毒性心肌炎小鼠中干細胞和端粒酶活性及TERT表達呈明顯時相性變化，提示在心肌損傷的病理狀態(tài)下，通過動員干細胞機制和調(diào)控端粒酶活性及TERT表達，促進受

6、損心肌細胞再生與修復，在病毒性心肌炎發(fā)病機制中具有重要意義。 第二部分黃芪甲甙對病毒性心肌炎心肌端粒酶作用的研究 目的：觀察黃芪甲甙不同劑量干預后對病毒性心肌炎小鼠端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的表達的影響，進一步探討其治療病毒性心肌炎的藥理作用機制。 方法：Balb/c雄性4周齡小鼠54只，隨機分為5組：A組(正?？瞻讓φ战M，腹腔接種0.1ml不含病毒的培養(yǎng)液+0.1ml羥甲基纖維素鈉鹽溶液灌胃2周，每日1次，

7、n=10)，B組(正常黃芪對照組，腹腔接種病毒培養(yǎng)液+0.1ml9％黃芪甲甙灌胃2周，每日1次，n=10)，C組(高劑量黃芪治療組，腹腔接種同劑量CVB3+0.1ml9％黃芪甲甙灌胃，n=10)，D組(低劑量黃芪治療組，腹腔接種同劑量CVB3+0.1ml1％黃芪甲甙灌胃，n=10)，E組(模型組，腹腔接種同劑量CVB3+羥甲基纖維素溶液灌胃，n=14)。觀察14d后，眼球采血后處死動物，摘取心臟組織。分析各組小鼠的死亡率；用TRAP—E

8、LISA法檢測外周血單個核細胞端粒酶活性；RT—PCR技術檢測心肌細胞TERT表達。 結果：A組，B組，C組，D組，E組的小鼠死亡率分別為0％、0％、10％、30％和50％，C組死亡率明顯低于D組和E組(p＜0.05)，后2組之間無顯著差異。TRAP—ELISA結果顯示，A組、B組和C組外周血單個核細胞端粒酶活性均呈陽性，三者之間無顯著差異，而D組和E組均為陰性。RT—PCR結果表明，C組TERT表達明顯高于D組和E組(p＜0.