實驗性自身免疫性心肌炎模型的建立及抗CD4單抗免疫干預作用的研究.pdf

1、本研究首先提取并純化豬心肌肌凝蛋白，應用自行提取得肌凝蛋白免疫Lewis大鼠，建立EAM模型，并深入地研究CD4<'+>T細胞亞群與心功能及心肌纖維化之間的動態(tài)相關關系，以進一步闡明免疫損傷在心肌炎進展過程中的作用機制。并首次將抗CD4單抗作為一種免疫調節(jié)劑應用于Lewis大鼠EAM的防治。明確其是否能夠誘導機體對心肌肌凝蛋白產(chǎn)生免疫耐受，以及通過免疫耐受的形成是否能夠對EAbl起到防治作用。以期更深入的了解自身免疫損傷在VMC發(fā)展成為

2、DCM過程中的作用機制，為心肌炎及心肌病的治療提供新的策略，同時也對其它自身免疫性疾病的治療提供重要的理論依據(jù)。 研究結果 1．本研究所獲得的肌凝蛋白粗提品的產(chǎn)率為15mg/g(心肌濕重)。純化后肌凝蛋白的產(chǎn)率為10mg/g。 2．提取肌凝蛋白Ca<'2+>-激活的ATP酶活性在純化前為0.19Piμmol/(mg．min)純化后為0.22Piμmol/(mg．min)。 3．提取各階段所得肌凝蛋白的純

3、度經(jīng)過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測顯示了隨著提取的進行，肌凝蛋白不斷的被從其它心肌蛋白中分離出來。粗提品在電泳圖譜上基本顯示3條帶，分別相當于肌凝蛋白的重鏈和兩組輕鏈。純化后蛋白的電泳圖譜與粗提品沒有明顯區(qū)別。 4．純化前蛋白質的A280/A260nm為0.52，而純化后的A280/A260nm比值1．45，提示純化后的肌凝蛋白核酸含量顯著下降。 5．加用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PA

4、GE)對所獲得的肌凝蛋白進行進一步鑒定顯示：native-PAGE泳道顯示在凝膠的頂端一條帶，SDS-PAGE泳道顯示為3條帶，推測native-PAGE泳道內(nèi)為非變性的肌凝蛋白，而SDS-PAGE泳道內(nèi)為變性的肌凝蛋白。 6.將標準肌凝蛋白作為Marker與提取蛋白同時進行電泳顯示了提取蛋白與標準蛋白的條帶基本相同。標準蛋白泳道內(nèi)可見雜質條帶，而提取蛋白泳道內(nèi)未見雜質蛋白的出現(xiàn)。 7.將native-PAGE泳道內(nèi)的蛋

5、白切下進行質譜分析，其肽指紋圖譜經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索結果證實提取蛋白為心肌肌凝蛋白。 8.EAM大鼠心臟超聲改變：初次免疫后第18天，超聲探及免疫組鼠大量心包積液，左室后壁及室間隔顯著增厚，心腔縮小，心功能較正常對照組及陰性對照組顯著降低，呈現(xiàn)急性期表現(xiàn)；初次免疫后30天免疫組鼠心包積液消失，室壁較18天變薄，但仍較正常對照組及陰性對照組厚，心功能呈現(xiàn)短暫的回升，呈現(xiàn)亞急性期表現(xiàn)；初次免疫后第49天，室壁厚度薄于正常及陰性對照組，心室

6、腔擴大，心功能再一次顯著地低于正常及陰性對照組，呈現(xiàn)慢性期擴張型心肌病的改變。 9.EAM大鼠心肌病理改變：初次免疫后第18天，免疫組鼠全部出現(xiàn)典型的心肌炎改變，H-E染色見心肌組織出現(xiàn)廣泛的炎細胞浸潤，伴有心肌壞死；初次免疫后第30天，心肌及間質炎細胞浸潤減少；第49天炎細胞浸潤基本消失。Masson三聯(lián)染色顯示了大量心肌纖維化的存在。 10.EAM大鼠血清抗心肌肌凝蛋白抗體改變：初次免疫后18天及30天，免疫組均檢測

7、到高滴度的抗體，而初次免疫后49天，抗體滴度卻顯著下降。 11.EAM大鼠血清Th1型細胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型細胞因子IL-6、IL-10的改變：Thl型細胞因子IFN-γ、IL一2在疾病的發(fā)病過程中均顯著升高，以初次免疫后第18天最為顯著，達到高峰，第30天和第49天逐漸降低；Th2型細胞因子IL-6、IL-10在初次免疫后第30天達到高峰，隨后逐漸下降。 12.EAM大鼠心肌Th1型細胞因子IFN-γ、

8、IL-2及Th2型細胞因子IL-4、IL-10mRNA表達的改變：Th1型細胞因子IFN-γ、IL-2在疾病的發(fā)病過程中均顯著升高，以初次免疫后第18天最為顯著，達到高峰，隨后逐漸下降；Th2型細胞因子IL-4、IL-10在初次免疫后18天已經(jīng)顯著升高，但在初次免疫后第30天達到高峰，隨后逐漸下降。 13.EAM大鼠細胞因子與心功能之間的相關關系：在初次免疫后18天和30天，LVFS與Th1型細胞因子之間存在顯著的負相關關系，與

9、Th2型細胞因子之間存在顯著的正相關關系(F(0.01)。然而，初次免疫后49天LVFS與血清Th1和Th2型細胞因子之間沒有顯著的相關關系(IFN-γ：r=-0.082，IL-2：r=-0.117,P>0.05：IL-6：r=O．436，IL-10：r=-0.031，P>0.005)，與心肌Th1和Th2型細胞因子mRNA的表達之間也沒有顯著的相關關系(IFN-γ：r=0.456．IL-2：r=-0.459，P>0.05：IL-6：r

10、=0.229，IL-10：r=-0.008，P>0.05)。初次免疫后49天Th1型細胞因子IFN-γ與心肌纖維化病理積分之間存在顯著的負相關關系(r=-0.83l，P<0.05)；Th2型細胞因子與心肌纖維化病理積分之間存在顯著的正相關關系(r=0.851，P<0.01)；心肌細胞因子mRNA的表達與心肌纖維化病理積分之間也顯示了類似的相關性。 14．初次免疫后18天抗CD4單抗誘導免疫耐受的情況： (1)抗CD4單

11、抗對于體外EAM大鼠淋巴細胞增殖反應的作用：抗CD4單抗治療組脾細胞對豬心肌肌凝蛋白的增殖反應顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組；而應用非特異性絲裂原刀豆蛋白A進行刺激時，各組織間無顯著差別。 (2)抗CD4單抗對血清抗心肌肌凝蛋白抗體的作用：抗CD4單抗治療組血清-抗心肌肌凝蛋白抗體顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組。 15．初次免疫后18天，抗CD4單抗對EAM的防治情況： (1)對EAM大鼠心臟

12、結構和功能的干預：抗CD4單抗治療組IVS和LVPW顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組，LVFS顯著高于鹽水治療對照組及IgG治療對照組。 (2)對EAM大鼠心肌炎癥及纖維化的防治：抗CD4單抗治療組鼠肉眼積分顯著輕于鹽水治療對照組及IgG治療對照組。鏡下觀察，抗CD4單抗治療組鼠心肌發(fā)現(xiàn)很少的炎細胞浸潤及纖維化的存在，病理積分顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組大鼠。 16．初次免疫后18天，抗CD4單抗對C

13、D4<'+>T細胞亞群分泌細胞因子的影響：抗CD4單抗的治療顯著降低了Th1型細胞因子的濃度，顯著上調了Th2型細胞因子的濃度。 研究結論：1．本研究應用生化方法提取出了高純度、高活性的心肌肌凝蛋白。 2．本研究應用自行提取的豬心肌肌凝蛋白成功的誘導產(chǎn)生了EAM模型。 3．ENd的病程進展呈現(xiàn)急性期、亞急性期、慢性期的改變。 4．CD4<'+>T細胞亞群Th1/Th2的失衡參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，直接導致了

14、急性期及亞急性期心功能紊亂和心室重構的發(fā)生。慢性期Th1/Th2型細胞因子可能通過干預纖維化的形成而對心功能的紊亂和心室重構起到重要的間接作用。 5．抗CD4單抗成功的誘導了EAM大鼠對心肌肌凝蛋白產(chǎn)生免疫耐受。通過免疫耐受的誘導成功的阻止了EAM的發(fā)生。進一步證實了CD4<'+>T細胞在EAM中的關鍵作用。 6．抗CD4單抗干預了輔助性T細胞亞群Th1/Th2的平衡，使平衡向Th2方向發(fā)生極化，可能是免疫耐受形成的機制

15、之一。 創(chuàng)新及意義 1．本研究對心肌肌凝蛋白的提取方法進行了改進，并加用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳及質譜分析對所提取蛋白質進行鑒定，避免了以往應用Westem blot進行鑒定的缺點。提取產(chǎn)率高于以往的提取方法，為心肌肌凝蛋白下一步在臨床和基礎研究中的應用打下了堅實的基礎。而且本文采用質譜分析技術不僅為其在醫(yī)學領域的應用提供了線索，而且也為此技術在大分子蛋白質分析方面的應用提供了有利的證據(jù)。 2．本研究利用自行提

16、取的心肌肌凝蛋白成功的誘導了EAM的發(fā)生，并對EAM的發(fā)病過程進行了多角度多時間點的檢測，將CD4<'+>T細胞亞群分泌的細胞因子與心功能的動態(tài)變化進行相關分析，進一步揭示了自身免疫損傷導致心功能紊亂及左室重構的作用及其機制。 3．本研究首次將抗CD4單抗應用于LOWis大鼠EAM的研究，成功地誘導了機體對心肌肌凝蛋白產(chǎn)生免疫耐受，阻止了EAM的發(fā)生發(fā)展。為人類VMC及DCM的治療提供了重要啟示。也為其他自身免疫性疾病的治療提供