實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型的建立及抗CD4單抗免疫干預(yù)作用的研究.pdf

1、本研究首先提取并純化豬心肌肌凝蛋白，應(yīng)用自行提取得肌凝蛋白免疫Lewis大鼠，建立EAM模型，并深入地研究CD4<'+>T細(xì)胞亞群與心功能及心肌纖維化之間的動(dòng)態(tài)相關(guān)關(guān)系，以進(jìn)一步闡明免疫損傷在心肌炎進(jìn)展過程中的作用機(jī)制。并首次將抗CD4單抗作為一種免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于Lewis大鼠EAM的防治。明確其是否能夠誘導(dǎo)機(jī)體對心肌肌凝蛋白產(chǎn)生免疫耐受，以及通過免疫耐受的形成是否能夠?qū)Abl起到防治作用。以期更深入的了解自身免疫損傷在VMC發(fā)展成為

2、DCM過程中的作用機(jī)制，為心肌炎及心肌病的治療提供新的策略，同時(shí)也對其它自身免疫性疾病的治療提供重要的理論依據(jù)。 研究結(jié)果 1．本研究所獲得的肌凝蛋白粗提品的產(chǎn)率為15mg/g(心肌濕重)。純化后肌凝蛋白的產(chǎn)率為10mg/g。 2．提取肌凝蛋白Ca<'2+>-激活的ATP酶活性在純化前為0.19Piμmol/(mg．min)純化后為0.22Piμmol/(mg．min)。 3．提取各階段所得肌凝蛋白的純

3、度經(jīng)過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測顯示了隨著提取的進(jìn)行，肌凝蛋白不斷的被從其它心肌蛋白中分離出來。粗提品在電泳圖譜上基本顯示3條帶，分別相當(dāng)于肌凝蛋白的重鏈和兩組輕鏈。純化后蛋白的電泳圖譜與粗提品沒有明顯區(qū)別。 4．純化前蛋白質(zhì)的A280/A260nm為0.52，而純化后的A280/A260nm比值1．45，提示純化后的肌凝蛋白核酸含量顯著下降。 5．加用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PA

4、GE)對所獲得的肌凝蛋白進(jìn)行進(jìn)一步鑒定顯示：native-PAGE泳道顯示在凝膠的頂端一條帶，SDS-PAGE泳道顯示為3條帶，推測native-PAGE泳道內(nèi)為非變性的肌凝蛋白，而SDS-PAGE泳道內(nèi)為變性的肌凝蛋白。 6.將標(biāo)準(zhǔn)肌凝蛋白作為Marker與提取蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳顯示了提取蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的條帶基本相同。標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道內(nèi)可見雜質(zhì)條帶，而提取蛋白泳道內(nèi)未見雜質(zhì)蛋白的出現(xiàn)。 7.將native-PAGE泳道內(nèi)的蛋

5、白切下進(jìn)行質(zhì)譜分析，其肽指紋圖譜經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果證實(shí)提取蛋白為心肌肌凝蛋白。 8.EAM大鼠心臟超聲改變：初次免疫后第18天，超聲探及免疫組鼠大量心包積液，左室后壁及室間隔顯著增厚，心腔縮小，心功能較正常對照組及陰性對照組顯著降低，呈現(xiàn)急性期表現(xiàn)；初次免疫后30天免疫組鼠心包積液消失，室壁較18天變薄，但仍較正常對照組及陰性對照組厚，心功能呈現(xiàn)短暫的回升，呈現(xiàn)亞急性期表現(xiàn)；初次免疫后第49天，室壁厚度薄于正常及陰性對照組，心室

6、腔擴(kuò)大，心功能再一次顯著地低于正常及陰性對照組，呈現(xiàn)慢性期擴(kuò)張型心肌病的改變。 9.EAM大鼠心肌病理改變：初次免疫后第18天，免疫組鼠全部出現(xiàn)典型的心肌炎改變，H-E染色見心肌組織出現(xiàn)廣泛的炎細(xì)胞浸潤，伴有心肌壞死；初次免疫后第30天，心肌及間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤減少；第49天炎細(xì)胞浸潤基本消失。Masson三聯(lián)染色顯示了大量心肌纖維化的存在。 10.EAM大鼠血清抗心肌肌凝蛋白抗體改變：初次免疫后18天及30天，免疫組均檢測

7、到高滴度的抗體，而初次免疫后49天，抗體滴度卻顯著下降。 11.EAM大鼠血清Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型細(xì)胞因子IL-6、IL-10的改變：Thl型細(xì)胞因子IFN-γ、IL一2在疾病的發(fā)病過程中均顯著升高，以初次免疫后第18天最為顯著，達(dá)到高峰，第30天和第49天逐漸降低；Th2型細(xì)胞因子IL-6、IL-10在初次免疫后第30天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。 12.EAM大鼠心肌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、

8、IL-2及Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10mRNA表達(dá)的改變：Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2在疾病的發(fā)病過程中均顯著升高，以初次免疫后第18天最為顯著，達(dá)到高峰，隨后逐漸下降；Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10在初次免疫后18天已經(jīng)顯著升高，但在初次免疫后第30天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。 13.EAM大鼠細(xì)胞因子與心功能之間的相關(guān)關(guān)系：在初次免疫后18天和30天，LVFS與Th1型細(xì)胞因子之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與

9、Th2型細(xì)胞因子之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(F(0.01)。然而，初次免疫后49天LVFS與血清Th1和Th2型細(xì)胞因子之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系(IFN-γ：r=-0.082，IL-2：r=-0.117,P>0.05：IL-6：r=O．436，IL-10：r=-0.031，P>0.005)，與心肌Th1和Th2型細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)之間也沒有顯著的相關(guān)關(guān)系(IFN-γ：r=0.456．IL-2：r=-0.459，P>0.05：IL-6：r

10、=0.229，IL-10：r=-0.008，P>0.05)。初次免疫后49天Th1型細(xì)胞因子IFN-γ與心肌纖維化病理積分之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.83l，P<0.05)；Th2型細(xì)胞因子與心肌纖維化病理積分之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.851，P<0.01)；心肌細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)與心肌纖維化病理積分之間也顯示了類似的相關(guān)性。 14．初次免疫后18天抗CD4單抗誘導(dǎo)免疫耐受的情況： (1)抗CD4單

11、抗對于體外EAM大鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用：抗CD4單抗治療組脾細(xì)胞對豬心肌肌凝蛋白的增殖反應(yīng)顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組；而應(yīng)用非特異性絲裂原刀豆蛋白A進(jìn)行刺激時(shí)，各組織間無顯著差別。 (2)抗CD4單抗對血清抗心肌肌凝蛋白抗體的作用：抗CD4單抗治療組血清-抗心肌肌凝蛋白抗體顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組。 15．初次免疫后18天，抗CD4單抗對EAM的防治情況： (1)對EAM大鼠心臟

12、結(jié)構(gòu)和功能的干預(yù)：抗CD4單抗治療組IVS和LVPW顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組，LVFS顯著高于鹽水治療對照組及IgG治療對照組。 (2)對EAM大鼠心肌炎癥及纖維化的防治：抗CD4單抗治療組鼠肉眼積分顯著輕于鹽水治療對照組及IgG治療對照組。鏡下觀察，抗CD4單抗治療組鼠心肌發(fā)現(xiàn)很少的炎細(xì)胞浸潤及纖維化的存在，病理積分顯著低于鹽水治療對照組及IgG治療對照組大鼠。 16．初次免疫后18天，抗CD4單抗對C

13、D4<'+>T細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子的影響：抗CD4單抗的治療顯著降低了Th1型細(xì)胞因子的濃度，顯著上調(diào)了Th2型細(xì)胞因子的濃度。 研究結(jié)論：1．本研究應(yīng)用生化方法提取出了高純度、高活性的心肌肌凝蛋白。 2．本研究應(yīng)用自行提取的豬心肌肌凝蛋白成功的誘導(dǎo)產(chǎn)生了EAM模型。 3．ENd的病程進(jìn)展呈現(xiàn)急性期、亞急性期、慢性期的改變。 4．CD4<'+>T細(xì)胞亞群Th1/Th2的失衡參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，直接導(dǎo)致了

14、急性期及亞急性期心功能紊亂和心室重構(gòu)的發(fā)生。慢性期Th1/Th2型細(xì)胞因子可能通過干預(yù)纖維化的形成而對心功能的紊亂和心室重構(gòu)起到重要的間接作用。 5．抗CD4單抗成功的誘導(dǎo)了EAM大鼠對心肌肌凝蛋白產(chǎn)生免疫耐受。通過免疫耐受的誘導(dǎo)成功的阻止了EAM的發(fā)生。進(jìn)一步證實(shí)了CD4<'+>T細(xì)胞在EAM中的關(guān)鍵作用。 6．抗CD4單抗干預(yù)了輔助性T細(xì)胞亞群Th1/Th2的平衡，使平衡向Th2方向發(fā)生極化，可能是免疫耐受形成的機(jī)制

15、之一。 創(chuàng)新及意義 1．本研究對心肌肌凝蛋白的提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，并加用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳及質(zhì)譜分析對所提取蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，避免了以往應(yīng)用Westem blot進(jìn)行鑒定的缺點(diǎn)。提取產(chǎn)率高于以往的提取方法，為心肌肌凝蛋白下一步在臨床和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。而且本文采用質(zhì)譜分析技術(shù)不僅為其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了線索，而且也為此技術(shù)在大分子蛋白質(zhì)分析方面的應(yīng)用提供了有利的證據(jù)。 2．本研究利用自行提

16、取的心肌肌凝蛋白成功的誘導(dǎo)了EAM的發(fā)生，并對EAM的發(fā)病過程進(jìn)行了多角度多時(shí)間點(diǎn)的檢測，將CD4<'+>T細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子與心功能的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行相關(guān)分析，進(jìn)一步揭示了自身免疫損傷導(dǎo)致心功能紊亂及左室重構(gòu)的作用及其機(jī)制。 3．本研究首次將抗CD4單抗應(yīng)用于LOWis大鼠EAM的研究，成功地誘導(dǎo)了機(jī)體對心肌肌凝蛋白產(chǎn)生免疫耐受，阻止了EAM的發(fā)生發(fā)展。為人類VMC及DCM的治療提供了重要啟示。也為其他自身免疫性疾病的治療提供