腎小管上皮細(xì)胞白蛋白超負(fù)荷在管周微血管網(wǎng)病變中作用的研究.pdf

1、一、研究背景 業(yè)已證實(shí)，腎小管間質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度與慢性腎臟疾病是否進(jìn)展為腎衰竭相關(guān)更為密切。引起腎小管間質(zhì)病變的原因比較復(fù)雜，其中蛋白尿的腎損傷作用已為大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)。研究表明，白蛋白超負(fù)荷重吸收可以激活腎小管上皮細(xì)胞，進(jìn)而引起腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等一系列病理生理變化，最終導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。近來研究提示，腎小管管周微血管(Peritubularcapillary，PTC)病變與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)

2、系十分密切，然而PTC損傷的原因及其可能機(jī)制等問題目前尚不清楚。 腎小管上皮細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)上與間質(zhì)成纖維細(xì)胞、管周微血管內(nèi)皮細(xì)胞等成分彼鄰。白蛋白的超負(fù)荷重吸收可損傷腎小管上皮細(xì)胞，進(jìn)而活化成纖維細(xì)胞，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，正常腎小管上皮細(xì)胞可表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)等血管生長因子，參與間質(zhì)微血管的發(fā)生/新生，在維護(hù)管周微血管正常結(jié)構(gòu)和生理功能上

3、具有舉足輕重的作用。在疾病狀態(tài)下，VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和修復(fù)。然而，目前還不清楚白蛋白超負(fù)荷引起腎小管上皮細(xì)胞損傷或激活后，是否會波及鄰近的管周微血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而引起管周微血管損傷，導(dǎo)致間質(zhì)缺血缺氧，加速腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程?如果蛋白尿腎損傷的作用存在上述機(jī)制，那么抑制白蛋白重吸收，尤其是針對頑固性蛋白尿患者，從腎小管上皮細(xì)胞重吸收途徑進(jìn)行干預(yù)，是否會減輕管周微血管的損傷進(jìn)而延緩慢性腎病向腎衰竭的進(jìn)展? 為求證上述問題，本研

4、究首先觀察了腎綜患者小管管周微血管網(wǎng)的變化與白蛋白超負(fù)荷重吸收的關(guān)系，以及白蛋白吞飲受體Cubilin在其中的重要作用。此外，還觀察了白蛋白超負(fù)荷對體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，旨在為解析蛋白尿相關(guān)性腎小管間質(zhì)損害機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。 二、方法 (一)腎綜患者腎小管白蛋白超負(fù)荷重吸收與管周微血管網(wǎng)變化的關(guān)系 1、選擇第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腎內(nèi)科2002年2月至2005年7月收治的50例腎病綜合征患者，腎

5、活檢病理診斷微小病變20例，IgA腎病(Lee氏Ⅱ級)10例，膜性腎病8例，輕度系膜增生性腎小球腎炎7例，局灶節(jié)段增生腎小球腎炎5例。對照組22例，6例為鏡下血尿患者，16例為腎腫瘤手術(shù)留取的腎組織標(biāo)本(取自遠(yuǎn)離病灶的正常腎組織)。經(jīng)常規(guī)病理檢查均未見明顯病理改變。 2、所有病例均留取尿液標(biāo)本測定尿白蛋白含量。腎小管上皮細(xì)胞Cubilin表達(dá)、白蛋白沉積、VEGF表達(dá)采用免疫組化SP法檢測；內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34、內(nèi)皮細(xì)胞增殖核

6、抗原Ki67采用雙重免疫組化SP染色方法檢測。微血管密度(microvesseldensity，MVD)和PTC管腔面積百分比按參考文獻(xiàn)報道的方法計(jì)算。 (二)同源重組型的Cubilin正、反義RNA腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 1、Cubilin正、反義RNA腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建 PCR擴(kuò)增大鼠Cubilin起始編碼區(qū)767bp的DNA片段，與T載體連接，測序鑒定連接方向，通過選擇反向(和同向)的雙酶切位點(diǎn)與腺病毒穿

7、梭載體pAdtack-CMV同時酶切和連接，構(gòu)建反向插入(正向插入作為正義對照)的腺病毒穿梭載體。將PmeⅠ線性化的腺病毒穿梭載體(pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB)轉(zhuǎn)染包含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的受體菌BJ5183(AdEasyTMXL)進(jìn)行同源重組。用含有卡那霉素的LB平板篩選同源重組陽性的克隆，PacⅠ酶切和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(293細(xì)胞)，經(jīng)病毒擴(kuò)增和CsCl密

8、度梯度超速離心純化后，再以260nm檢測OD值和熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞數(shù)的方法計(jì)算重組腺病毒的滴度。 2、Cubilin正、反義RNA腺病毒表達(dá)載體的鑒定 以Cubilin正、反義RNA腺病毒感染大鼠腎小管上皮細(xì)胞(RatRenalTubularEpithelialCell，RRTEpiC)，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光蛋白(GreenFluorescenceProtein，GFP)的表達(dá)情況；實(shí)時熒光定

9、量PCR檢測反義RNA腺病毒表達(dá)載體對RRTEpiC內(nèi)源性CubilinmRNA表達(dá)的抑制作用。 (三)白蛋白超負(fù)荷對腎小管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 1、白蛋白超負(fù)荷與腎小管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的量效關(guān)系 RRTEpiC細(xì)胞按1×104細(xì)胞/孔接種至96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后，以無血清DMEM培養(yǎng)24h后，換以新鮮無血清DMEM培養(yǎng)液，除對照組外，其余各組分別加HSA至終濃度為0.5、2.0、5.0、10mg/m

10、L，每組6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。ELISA法檢測各組RRTEpiC細(xì)胞VEGF的表達(dá)。 2、Cubilin反義RNA對白蛋白下調(diào)VEGF表達(dá)的干預(yù)作用 將RRTEpiC分成五組：空白對照組，白蛋白組，pAdEasy-1組(腺病毒空載體組)，pAdEasy-CUB組(Cubilin正義RNA腺病毒組)，pAdEasy-ACUB組(Cubilin反義RNA腺病毒組)。除空白對照組外，其余各組在無血清DMEM培養(yǎng)液中加入人血

11、清白蛋白，終濃度為10mg/ml。37℃，5％CO2培養(yǎng)24h。提取細(xì)胞總蛋白經(jīng)WesternBlot方法檢測VEGF的表達(dá)。 三、結(jié)果 (一)腎綜患者腎小管上皮細(xì)胞白蛋白超負(fù)荷與管周微血管網(wǎng)變化的關(guān)系 與對照組比較，腎病綜合征組腎小管上皮細(xì)胞白蛋白吞飲受體Cubilin表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)白蛋白沉積顯著增加(P＜0.01)，微血管管腔開放不良，MVD、增殖核抗原Ki67陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管VEGF表達(dá)均顯

12、著減少(P＜0.01)。相關(guān)性分析顯示，腎小管上VEGF表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)白蛋白沉積呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-0.676，P＜0.05)；間質(zhì)MVD與小管上皮細(xì)胞內(nèi)白蛋白沉積之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-0.587，P＜0.05)；間質(zhì)MVD與腎小管上VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(γ=0.534，P＜0.05)。 (二)同源重組型Cubilin反義RNA腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 1、Cubilin正、反義RNA腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建

13、 酶切及測序結(jié)果證明，插入腺病毒表達(dá)載體(pAdEasy-1)的正、反義Cubilin片段序列與已知Cubilin(序列號NM053332)序列一致，表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Cubilin正、反義RNA腺病毒表達(dá)載體；擴(kuò)增、純化病毒并測定其滴度分別為1.8×1010pfu/ml，2.0×1010pfu/ml。 2、Cubilin正、反義RNA腺病毒表達(dá)載體的鑒定 熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，白蛋白組，p

14、AdEasy-1組和pAdEasy-CUB組RRTEpiC細(xì)胞CubilinmRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，但三組間比較CubilinmRNA表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)；pAdEasy-ACUB組CubilinmRNA表達(dá)與空白對照組相比略有增加卻無顯著性差異(P＞0.05)，但顯著低于白蛋白組(P＜0.05)。 (三)白蛋白超負(fù)荷重吸收對腎小管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響 1、白蛋白超負(fù)荷與腎小管上皮細(xì)胞VE

15、GF表達(dá)的量效關(guān)系 對照組RRTEpiC細(xì)胞有VEGF表達(dá)；白蛋白孵育24h后，0.5mg/mLHSA組細(xì)胞VEGF的表達(dá)與對照組無顯著性差異(P＞0.05)；其余各組與對照組比較，VEGF表達(dá)顯著減少(P＜0.05)，且與白蛋白濃度存在量效依賴關(guān)系。 2、Cubilin反義RNA對白蛋白下調(diào)VEGF表達(dá)的干預(yù)作用 WesternBlot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，白蛋白組、pAdEasy-1組、pAdEasy-

16、CUB組RRTEpiC細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，但三組間比較VEGF表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)；pAdEasy-ACUB組VEGF表達(dá)與空白對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，但顯著高于白蛋白組(P＜0.05)。 四、結(jié)論 (一)腎病綜合征患者腎間質(zhì)病變早期，管周微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖受抑制，微血管網(wǎng)密度降低，腎小管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)顯著減少；管周微血管網(wǎng)密度與小管上皮細(xì)胞白蛋白沉積呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)