高保真DNA聚合酶分子開關用于TP53基因熱點突變的檢測.pdf

1、目的：利用硫化修飾的堿基特異性引物偶聯(lián)高保真酶所構成的突變敏感性分子“開/關”系統(tǒng)檢測TP53基因的熱點突變（G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T）。同時結合實時熒光定量PCR技術，通過擴增曲線和熔解曲線準確、快速地判斷6個熱點突變的存在與否，并對突變進行半定量分析。
　　方法：將包含上述六個密碼子的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，并轉化至DH5α感受態(tài)細胞，通過LB/Amp/IPTG/X-g

2、al平板篩選出白色克隆，利用載體通用引物和PCR引物對其進行菌液PCR初步鑒定，并通過測序分析進行確證，得到TP53基因的野生模板質粒。采用重疊延伸PCR技術，對所需位置的堿基進行定點突變，分別得到6種突變基因型PCR產(chǎn)物，克隆并用同樣方法篩選出陽性克隆，經(jīng)測序確證得到分別含有TP53基因G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T的突變質粒模板。然后以這六個突變位點為檢測靶點，分別設計3’末端與野生型基因位點

3、或突變型基因位點配對的硫化修飾引物；利用高保真DNA聚合酶接到突變敏感性分子開關，對TP53基因野生型質粒模板和6種突變型質粒模板進行檢測，并通過凝膠成像系統(tǒng)進行分析；采集正常人以及腫瘤患者的組織或血樣標本，通過臨床樣本對檢測方法進行評估，并對腫瘤樣本進行TP53基因6個熱點突變的篩查。結合熒光定量PCR技術，評估高保真酶介導的敏感性分子開關在熒光定量PCR中的敏感性和相關性。
　　結果：通過在不同的反應體系中分別對六個熱點突變進

4、行檢測。結果顯示，在高保真DNA聚合酶介導的PCR反應體系中，僅完全配對引物得以延伸，不完全配對引物則不被延伸，即3’端硫化修飾突變檢測引物僅對配對的突變模板有擴增產(chǎn)物，對野生模板無擴增產(chǎn)物。運用該檢測方法對20例臨床健康志愿者和29例癌癥患者的組織及血樣做檢測，未發(fā)現(xiàn)TP53基因的G175A，G245A，C248T，G249T，G273A和C282T突變，檢測結果與測序結果一致。由此可以看出，突變敏感分子開關對體細胞突變的檢測具有很好

5、的特異性及敏感性。
　　結論：本研究充分利用高保真DNA聚合酶偶聯(lián)硫化引物構成的突變敏感性分子開關成功開發(fā)出了可準確檢出TP53基因175，245，248，249，273和282號密碼子單堿基突變的新方法，并通過對不同類型的臨床標本的檢測，驗證了其高敏感性和高效性。該技術除可用于檢測血液基因組DNA的遺傳性突變外，還可以檢測血中游離DNA中存在的微量體細胞基因突變。該技術在TP53基因篩查中具有較大的潛在應用價值，能夠對含有上述T