鼻咽癌組織中磷酸果糖激酶1的表達(dá)及RNA干擾靶向沉默磷酸果糖激酶1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2生物學(xué)特性的影響.pdf

1、本文分兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分:鼻咽癌組織中磷酸果糖激酶1的表達(dá)及其酶活性檢測(cè)
　　目的：檢測(cè)鼻咽部正常組織、癌組織中糖酵解途徑關(guān)鍵限速酶-磷酸果糖激酶i(phosphofructokinasel,PFK1)的mRNA和蛋白表達(dá)水平及其酶活性，分析磷酸果糖激酶1與鼻咽癌生物學(xué)特性的關(guān)系。
　　方法：采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)的方法，鼻咽癌組織活檢標(biāo)本來(lái)自41位鼻咽癌的患者，對(duì)照組活檢標(biāo)本來(lái)自20位鼻咽部慢性炎癥的患者鼻

2、咽部組織，采取實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢查PFKlmRNA的表達(dá)水平，采取免疫印跡法（Western-blot)檢測(cè)PFK1蛋白的表達(dá)；酶學(xué)分析的方法檢測(cè)PFK1酶活性。
　　結(jié)果：在鼻咽部的活檢標(biāo)本中，①鼻咽癌組中的PFK1mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平及其酶活性均明顯高于鼻咽部慢性炎性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)，②在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組中PFK1 mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平及其酶活性均明顯高于無(wú)伴淋巴結(jié)

3、轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)。
　　結(jié)論：PFK1與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能作為鼻咽癌的分子標(biāo)志物之一，特異性抑制PFK1有可能成為治療鼻咽癌的新策略。
　　第二部分:RNA干擾靶向沉默磷酸果糖激酶1的表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2生物學(xué)特性的影響
　　目的：惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑增強(qiáng)，而磷酸果糖激1(phosphofructokinase1,PFK1)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，本研究通過(guò)構(gòu)建shR

4、NA-PFK1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞,分析鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。
　　方法：構(gòu)建4條s_A-PFK1質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至鼻咽癌CNE2細(xì)胞中,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-PCR)檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PFK1mRNA的表達(dá)變化，將抑制效率最高的shRNA-PFK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞,RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PFK1mRNA表達(dá)的變化，免疫印跡法（Western-blot

5、)檢測(cè)PFK1蛋白表達(dá)的變化，酶學(xué)分析的方法檢測(cè)PFK1酶活性的變化，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡變化，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外遷移能力的變化，Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞體外侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：4條shRNA-PFK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞后，質(zhì)粒sh-H-PFK1-507的f值較其余3條質(zhì)粒及空白對(duì)照組、質(zhì)粒對(duì)照組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01),有抑

6、制作用,且抑制效率最高。實(shí)驗(yàn)組CNE2細(xì)胞在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒sh-H-PFK1-507后PFK1 mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組、質(zhì)粒對(duì)照組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，PFK1蛋白表達(dá)量與其他兩組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，PFK1酶活性與其他兩組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組在24h、36h、48h、72h的吸光度值明顯低于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05)，實(shí)驗(yàn)

7、組細(xì)胞增殖能力收到抑制。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、質(zhì)粒對(duì)照組相比凋亡比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體外遷移能力明顯低于空白對(duì)照組與質(zhì)粒對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.01)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體外侵襲能力明顯低于空白對(duì)照組與質(zhì)粒對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.01)。
　　結(jié)論：shRNA-PFK1通過(guò)抑制鼻咽癌細(xì)胞PFK1的表達(dá)，進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖能力、體外遷移能力和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能成為治療