膠原修飾溫致水凝膠包載GDF-5轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞修復(fù)大鼠椎間盤退變.pdf

1、第一部分過表達(dá)GDF-5基因大鼠脂肪千細(xì)胞構(gòu)建的條件探索和篩選
　　目的:探索慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)GDF-5基因大鼠脂肪干細(xì)胞(ASCs)的構(gòu)建條件和純度篩選。
　　方法:取大鼠腹股溝脂肪墊組織，采用Ⅰ型膠原酶消化貼壁培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)大鼠ASCs。倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，CCK-8法測定細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。制備帶GDF-5/GFP嵌合基因的慢病毒載體系統(tǒng)，探索不同感染復(fù)數(shù)(MOI)(MOI=1，

2、5，10，20，40，60，80，100)的轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)，采用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞行流式細(xì)胞篩選，測定篩選后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽性率。篩選出的細(xì)胞行細(xì)胞爬片，DAPI染色，形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞陽性率。并采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)大鼠ASCs，流式細(xì)胞免疫表型鑒定:間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表達(dá)陽性，造血細(xì)胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓

3、干細(xì)胞表面抗原(CD106)表達(dá)陰性。成功構(gòu)建GDF-5過表達(dá)慢病毒載體系統(tǒng)，慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠ASCs最佳MOI為40，轉(zhuǎn)染率為65％。通過GFP熒光流式細(xì)胞篩選技術(shù)，可將轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性率提高至96％。體外傳代后陽性細(xì)胞率無明顯減少。CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力、生長曲線與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異。
　　結(jié)論:膠原酶消化法可成功培養(yǎng)大鼠ASCs。慢病毒介導(dǎo)GDF-5/GFP嵌合基因轉(zhuǎn)染大鼠ASCs的最佳MOI為40，轉(zhuǎn)染率為65％。流式

4、細(xì)胞篩選技術(shù)可顯著提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性率，對細(xì)胞活力無顯著影響。
　　第二部分過表達(dá)GDF-5基因大鼠ASCs的鑒定和分化評估
　　目的:評估轉(zhuǎn)染GDF-5基因大鼠ASCs表達(dá)GDF-5基因、蛋白的有效性，并評估其能否向髓核樣細(xì)胞分化。
　　方法:收集篩選后GDF-5基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光定量Real-time PCR檢測GDF-5基因表達(dá)情況，Western Blot檢測檢測GDF-5蛋白表達(dá)。收集GDF-5基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)

5、上清液，Elisa檢測上清液中GDF-5含量。細(xì)胞不添加額外誘導(dǎo)劑體外培養(yǎng)7天后，收集細(xì)胞行Real-time PCR檢測髓核樣細(xì)胞標(biāo)記物Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表達(dá)情況，Western Blot檢測檢測Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表達(dá)情況。比較GDF-5基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞在上述基因和蛋白表達(dá)的差異，評估基因轉(zhuǎn)染、蛋白表達(dá)的有效性，以及轉(zhuǎn)染GDF-5基因ASCs是否能顯著表達(dá)髓核樣細(xì)

6、胞標(biāo)記物。對GDF-5基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的行細(xì)胞爬片，免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan的表達(dá)和胞內(nèi)定位。
　　結(jié)果:GDF-5慢病毒轉(zhuǎn)染組的基因和蛋白水平與空白對照組相比較均顯著性增高(P＜0.001)，說明目的基因轉(zhuǎn)染有效。Elisa法檢測細(xì)胞上清液中GDF-5含量為（151.7±33.2）ng/ml，顯著性高于空白對照組(P＜0.001)。細(xì)胞培養(yǎng)7天后，Real-time PCR、Wester

7、n Blot結(jié)果顯示三種髓核樣細(xì)胞標(biāo)記物Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan的基因和蛋白表達(dá)水平，GDF-5慢病毒轉(zhuǎn)染組均顯著性高于空白對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。免疫細(xì)胞熒光從形態(tài)學(xué)上證明轉(zhuǎn)染GDF-5的ASCs髓核細(xì)胞樣標(biāo)記物Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan呈陽性表達(dá)。其中Sox9主要表達(dá)在細(xì)胞核、CollagenⅡ主要表達(dá)在胞質(zhì)中，Aggrecan在胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。
　　結(jié)論:過表

8、達(dá)GDF-5基因大鼠ASCs可有效表達(dá)GDF-5基因和蛋白，并能分泌至細(xì)胞外，且在不額外添加誘導(dǎo)劑的情況下能在基因、蛋白及形態(tài)學(xué)上向髓核樣細(xì)胞分化。
　　第三部分膠原修飾溫致水凝膠的制備和生物相容性評估
　　目的:制備Ⅱ型膠原修飾的溫致水凝膠（Collagen/Hydrogels），進(jìn)行表征測定和評估其生物相容性。
　　方法:采用開環(huán)聚合方法合成PCLA-PEG-PCLA三嵌段共聚物水凝膠，0.1％Ⅱ型膠原修飾后行鈷6

9、0輻照滅菌，核磁共振及體積排除色譜測定輻照前后凝膠分子量，倒管法及流變儀測定相轉(zhuǎn)變溫度。測定修飾后前后凝膠的體外降解過程中的物理形貌及浸提液pH。MTT法測定凝膠包載細(xì)胞后的細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI法測定含修飾后凝膠培養(yǎng)液能否致使細(xì)胞凋亡或死亡。大鼠頸部皮下埋植檢測其體內(nèi)生物相容性。
　　結(jié)果:采用開環(huán)聚合方法可成功合成PCLA-PEG-PCLA三嵌段共聚物水凝膠，Ⅱ型膠原修飾及鈷60輻照滅菌后凝膠分子量無明顯變

10、化，對成膠溫度無顯著影響。膠原修飾后對凝膠形態(tài)學(xué)維持有所提高，降解產(chǎn)物浸提液的pH呈中性。MTT檢測結(jié)果表明細(xì)胞在膠原修飾后凝膠中的活力相比在單純凝膠中得到有效提高。流式細(xì)胞凋亡測試表明不同梯度的含膠原修飾后凝膠的培養(yǎng)液不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。皮下埋植實(shí)驗(yàn)未見炎性細(xì)胞浸潤，表明凝膠體內(nèi)組織相容性好。
　　結(jié)論:Ⅱ型膠原對PCLA-PEG-PCLA水凝膠支架進(jìn)行修飾可提高其細(xì)胞粘附活性和增殖能力，對凝膠本身的溫敏性無顯著影響。修飾后

11、的水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性
　　第四部分膠原修飾溫致水凝膠包載過表達(dá)GDF-5脂肪干細(xì)胞修復(fù)大鼠椎間盤退變
　　目的:評估膠原修飾溫致水凝膠包載GDF-5基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞(ASCs)修復(fù)大鼠椎間盤退變的效果。
　　方法:采用膠原修飾溫致水凝膠包載轉(zhuǎn)染GDF-5脂肪干細(xì)胞(ASCs)包載移植細(xì)胞，X線透視下用21G穿刺針針刺大鼠尾椎纖維環(huán)至髓核中央，進(jìn)行抽吸，在Co5/Co6、Co7/Co8、Co8/Co

12、9間盤水平進(jìn)行操作，Co6/Co7為正常對照。針刺后，Co5/Co6間盤通過微量注射器給予PBS2μl，作為陰性對照組。Co7/Co8、Co8/Co9間盤按不同處理措施分組如下:(1)ASCs-GDF5+Col/Gel組:膠原修飾水凝膠中包載GDF-5基因轉(zhuǎn)染的大鼠ASCs;(2) ASCs-GDF5+Gel組:單純水凝膠中包載GDF-5基因轉(zhuǎn)染的大鼠ASCs;(3) ASCs-GDF5+PBS組:含GDF-5基因轉(zhuǎn)染大鼠ASCs的PB

13、S液;(4) ASCs+Col/Gel組:膠原修飾水凝膠中包載無GDF-5基因轉(zhuǎn)染的大鼠ASCs;(5) ASCs+Gel組:單純水凝膠中包載無GDF-5基因轉(zhuǎn)染的大鼠ASCs;(6) ASCs+PBS組:含無DF-5基因轉(zhuǎn)染大鼠ASCs的PBS液;(7) Col/Gel組:僅注射膠原修飾水凝膠;(8) Gel組:僅注射單純水凝膠溶液。注射液體體積均為2μl。移植后每兩周通過細(xì)胞自帶GFP應(yīng)該觀察細(xì)胞存活情況。移植30天、60天、90天

14、后行大鼠尾椎X線檢查，計(jì)算并比較相對椎間隙指數(shù)(DHI(％))變化，并行HE染色、番紅O-快綠染色、甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行組織學(xué)評估。
　　結(jié)果:體內(nèi)示蹤表明移植后4周仍可觀察到移植細(xì)胞GFP熒光，形態(tài)學(xué)上有分化。對同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組DHI(％)比較:ASCs-GDF5+Col/Gel組、ASCs-GDF5+PBS組、ASCs+Col/Gel組在移植后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于PBS組(P＜0.05)。移植后90天，ASCs-GDF5+Ge

15、l組、ASCs+PBS組的DHI(％)也均優(yōu)于PBS組（P＜0.05）。對同一處理組在不同時(shí)間點(diǎn)DHI(％)比較:ASCs-GDF5+Col/Gel組與ASCs+Col/Gel組移植90天后與移植30天相比DHI(％)均得到了一定提高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ASCs-GDF5+Gel組、ASCs-GDF5+PBS組及ASCs+PBS組在三個(gè)時(shí)間段中DHI(％)無顯著性變化(P＞0.05)，而ASCs+Gel組、Col/Ge

16、l組、Gel組及PBS組的DHI(％)在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈下降趨勢，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　陰性對照PBS組在針刺造模30天后椎間盤發(fā)生退變，說明椎間盤模型制備成功。HE組織學(xué)評分，在移植術(shù)后同一時(shí)間點(diǎn)中，ASCs-GDF5+Col/Gel組、ASCs-GDF5+Gel組、ASCs-GDF5+PBS組、ASCs+Col/Gel組的HE染色組織學(xué)評分結(jié)果要顯著低于陰性對照PBS組，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在所有

17、組別中ASCs-GDF5+Col/Gel組評分顯著低于其他組(P＜0.05)，修復(fù)效果椎間盤效果最為顯著。ASCs-GDF5+Col/Gel組在移植后的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，組織學(xué)評分無顯著性升高(P＞0.05)，而其它組在穿刺移植術(shù)后90天相比術(shù)后30天，組織學(xué)評分顯著性升高(P＜0.05)。所有組的間盤均未見炎性細(xì)胞浸潤等急性或慢性炎癥的組織學(xué)表現(xiàn)。
　　結(jié)論:Ⅱ型膠原修飾的PCLA-PEG-PCLA水凝膠包載過表達(dá)GDF-5基因大鼠