胃癌中ER-α36與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究.pdf

1、胃癌是世界上第四常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤的第二位。治療以手術(shù)切除為主，效果不佳，5年生存率為26％。流行病學(xué)的調(diào)查顯示，雌激素（estrogen）和胃癌發(fā)生有關(guān)。胃癌發(fā)病存在男女性別差異，男性約為女性的2～3倍，女性絕經(jīng)期后與男性的這種差異消失。雌激素在胃癌發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮作用目前還不清楚。
　　雌激素通過(guò)與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合發(fā)揮多種生理和病理效應(yīng)。雌激素受體有四個(gè)亞型：ER-α6

2、6、ER-α46、ER-α36和ER-β。ER-α36是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)雌激素受體，是ER-α66（即經(jīng)典的ER-α）的剪切變異體。與全長(zhǎng)的ER-α66比較，ER-α36缺少AF-1和AF-2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，但是保留了DNA結(jié)合區(qū)和部分二聚體化及雌激素結(jié)合區(qū)，并且在羧基末端有一個(gè)特異的由27個(gè)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，ER-α36主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK/ERK、PI3K/Akt等信號(hào)通路發(fā)揮雌激素的非基因組效

3、應(yīng)，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在ER陰性（即ER-α66陰性）的乳腺癌中的進(jìn)一步研究表明，ER-α36與EGFR相互作用，激活MAPK/ERK、PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factorreceptor，EGFR）屬于受體酪氨酸激酶家族成員之一?；罨腅GFR可以激活MAPK/ERK、PI3K/Akt等信號(hào)通路，將細(xì)胞外的有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)

4、，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、粘附以及遷移等活動(dòng)。EGFR在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。
　　以前的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌低表達(dá) ER-α66（2～28％）和ER-β，由此認(rèn)為胃癌是非雌激素依賴的腫瘤。本課題組在前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞株BGC823、SGC7901、AGS、MKN45中均可檢測(cè)出ER-α36mRNA和ER-α66mRNA，且ER-α36表達(dá)量高于ER-α66。ER-α36 mRNA在癌組織中的表達(dá)量要

5、高于癌旁組織和正常組織，ER-α66 mRNA的表達(dá)量則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。這提示ER-α36在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用可能大于ER-α66。
　　但是，ER-α36在胃癌中所發(fā)揮的作用機(jī)制并不清楚。在胃癌細(xì)胞中，ER-α36是否和乳腺癌中一樣，與EGFR存在相互作用從而激活相關(guān)信號(hào)通路？為解決這個(gè)問(wèn)題，本研究設(shè)計(jì)三個(gè)實(shí)驗(yàn)。
　　第一部分：胃癌組織中ER-α36蛋白的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系的研究。搜集存檔的人體胃癌組織標(biāo)本蠟塊，構(gòu)建

6、組織芯片，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)ER-α36蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)其臨床病理意義。
　　第二部分：胃癌組織中ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白的表達(dá)及其相互關(guān)系的研究。利用新鮮冰凍的人體胃癌組織，用Western blot方法檢測(cè)ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白的表達(dá)及其相互關(guān)系。從組織水平研究胃癌中ER-α36是否和EGFR-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　第三部分：胃癌細(xì)胞中ER-α36與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系

7、的研究。構(gòu)建胃癌細(xì)胞SGC7901穩(wěn)定高表達(dá)ER-α36（SGC7901-High36）和低表達(dá)ER-α36的重組細(xì)胞株（SGC7901-Low36）。用EGF作用于正常、高表達(dá)ER-α36、低表達(dá)ER-α36的胃癌細(xì)胞SGC7901，Western blot方法檢測(cè)三種細(xì)胞中P-ERK蛋白的表達(dá)。從細(xì)胞水平研究胃癌中ER-α36是否和EGFR-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　第一部分 胃癌組織中ER-α36蛋白的表達(dá)與臨床病理特征

8、關(guān)系的研究
　　目的：檢測(cè)胃癌組織中ER-α36蛋白的表達(dá)情況及其與各項(xiàng)臨床病理特征關(guān)系。方法：應(yīng)用組織芯片技術(shù)制作67例胃癌組織芯片，4μm連續(xù)切片2張分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。觀察組織芯片可供分析病例中ER-α36蛋白的表達(dá)情況，并分析其與各項(xiàng)臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：制作的67例胃癌組織芯片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后可分析病例為53例，可分析率79.1％。胃癌組織中存在ER-α36蛋白的表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。有

9、33例胃癌組織表達(dá)ER-α36蛋白，陽(yáng)性表達(dá)率62.3％。ER-α36蛋白在腸型胃癌的表達(dá)比彌漫/混合型胃癌高，與性別、年齡、腫塊大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理學(xué)指標(biāo)無(wú)關(guān)。結(jié)論：胃癌組織中存在ER-α36蛋白的表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率62.3％（33/53）。腸型胃癌中ER-α36蛋白表達(dá)更高。
　　第二部分 胃癌組織中ER-α36、EGFR、P-ERK蛋白表達(dá)相互關(guān)系的研究
　　目的：研究胃癌組織中ER-α36與EGFR、P-E

10、RK蛋白表達(dá)相關(guān)性。方法：用Western blot方法檢測(cè)24例新鮮冰凍的人體胃癌組織中ER-α36、EGFR和P-ERK蛋白的表達(dá)。結(jié)果：24例胃癌組織中，ER-α36蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為75％（18/24），EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為70.8％（17/24），P-ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為58.3％（14/24）。ER-α36蛋白陽(yáng)性表達(dá)的胃癌病例組中EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（88.9％，16/18）高于ER-α36蛋白陰性表達(dá)病例組（16.

11、7％，1/6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的胃癌病例組中ER-α36蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（94.1％，16/17）高于EGFR蛋白陰性表達(dá)病例組（28.6％，2/7），差異明顯（P＜0.01），表明ER-α36表達(dá)和EGFR相關(guān)。ER-α36蛋白陽(yáng)性表達(dá)的胃癌病例組中P-ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（72.2％，13/18）高于ER-α36蛋白陰性表達(dá)病例組（16.7％，1/6），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明ER

12、-α36表達(dá)和P-ERK相關(guān)。EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的胃癌病例組中P-ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（76.5％，13/17）高于EGFR蛋白陰性表達(dá)病例組（14.3％，1/7），差異明顯（P＜0.01），表明EGFR表達(dá)和P-ERK相關(guān)。在13例EGFR和P-ERK蛋白同時(shí)陽(yáng)性的病例中，ER-α36蛋白陽(yáng)性率為92.3％（12/13），13例ER-α36和P-ERK蛋白同時(shí)陽(yáng)性的病例中，EGFR蛋白陽(yáng)性率也為92.3％（12/13），ER-α36

13、、EGFR、P-ERK的表達(dá)相關(guān)。結(jié)論：ER-α36與EGFR-ERK通路相關(guān)。
　　第三部分 胃癌細(xì)胞中ER-α36與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系的研究
　　目的：研究胃癌細(xì)胞中ER-α36與EGF刺激的EGFR-ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系。方法：用慢病毒轉(zhuǎn)染的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建胃癌細(xì)胞SGC7901穩(wěn)定高表達(dá)ER-α36（SGC7901-High36）和低表達(dá)ER-α36的重組細(xì)胞株（SGC7901-Low36）。用EGF作用

14、于正常、高表達(dá)ER-α36、低表達(dá)ER-α36的胃癌細(xì)胞SGC7901，Western blot方法檢測(cè)三種細(xì)胞中P-ERK蛋白的表達(dá)。結(jié)果：EGF作用于SGC7901細(xì)胞后，P-ERK蛋白的表達(dá)與EGF有濃度和時(shí)間依賴的關(guān)系。EGF作用于高表達(dá)ER-α36的SGC7901細(xì)胞后，P-ERK蛋白高表達(dá)；作用于低表達(dá)ER-α36的SGC7901細(xì)胞后，P-ERK蛋白低表達(dá)。結(jié)論：胃癌細(xì)胞中ER-α36通過(guò)EGF刺激的EGFR-ERK信號(hào)傳