香連丸的質量標準及其活性組分的藥物代謝動力學研究.pdf

1、香連丸是由黃連和木香組成的復方制劑，具有清熱化濕，行氣止痛的功效，主治濕熱痢疾、里急后重、腹痛泄瀉、菌痢、腸炎。方中黃連占80％，為主藥；木香則起重要的輔助作用；吳茱萸制黃連抑制黃連苦寒之性，使其寒而不滯。近年來關于香連丸的質量研究以小檗堿的含量測定為主。隨著中藥現代化進程的加快，單單以一種活性組分的含量對中藥制劑進行質量控制已遠遠不能滿足現代中藥發(fā)展的需要。為了提升中藥復方制劑香連丸的質量控制水平，我們對香連丸中三種生物堿和兩種倍半萜

2、內酯類化合物進行了含量測定研究，并建立了香連丸中生物堿類成分的指紋圖譜，以期為全面控制香連丸的質量提供方法基礎。眾所周知，中藥之所以具有豐富的活性，依賴于其豐富的活性組成成分，這些活性組分的體內動態(tài)變化規(guī)律研究可以為其活性作用機理的闡釋提供理論基礎，為其臨床用藥提供科學依據；目前尚未見香連丸中活性組分的體內動態(tài)變化規(guī)律研究的報道。鑒于此，我們對來自于香連丸的兩種中藥活性倍半萜內酯-木香烴內酯和去氫木香內酯在小鼠體內的藥物代謝動力學進行了

3、研究；并詳細研究了這兩種活性組分在小鼠各組織中的分布。另外，為了給體內過程研究提供物質基礎，我們建立了木香中的活性成分木香烴內酯和去氫木香內酯的反相高效液相(RP-HPLC)半制備方法。
　　 主要研究內容包括以下三個方面：
　　 一.香連丸的質量標準研究
　　 1.建立了香連丸中三種季胺型生物堿巴馬汀、藥根堿和小檗堿含量測定方法。本實驗采用高效液相膠束色譜，Kromasil ODS(5μm，4.6 mm×150

4、 mm)色譜柱，流動相：0.2 mol.L-1NaH2PO4水溶液-7.00 mmol.L-1十二烷基硫酸鈉-乙腈(35∶35∶30，V∶V∶V)，流速1.0 mL.min-1，柱溫30℃，檢測波長為350 nm。香連丸中小檗堿、藥根堿和巴馬汀的標準曲線分別為A=3.37×104X-2.65×104(r=0.9999)，A=4.58×103X-2.88×103(r=0.9997)，A=5.62×103X-9.46×103(r=0.999

5、4)；平均回收率分別為87.67％(RSD=0.17)，102.37％(RSD=0.98)，96.81％(RSD=3.13)。按照該方法測定了市售及自制香連丸中小檗堿、藥根堿和巴馬汀的含量，結果顯示它們的平均含量分別為45.77 mg.g-1，3.89 mg.g-1，9.88 mg.g-1(佛慈藥廠)；86.53 mg.g-1，16.66 mg.g-1，18.59 mg.g-1(自制香連丸)。
　　 2.建立了香連丸中兩種倍半萜

6、內酯-木香烴內酯和去氫木香內酯的含量測定方法。本實驗采用反相高效液相色譜，Hypersil ODS(5μm，4.6mm×250mm)色譜柱，流動相：乙腈-水(70∶30，V∶V)，流速1.0 mL.min-1，柱溫30℃，檢測波長為210 nm測定木香烴內酯和去氫木香內酯的含量。其標準曲線，相關系數及線性范圍分別為A=1.30×105X-3.38×104(r=0.9998)，0.0223～0.178 mg.ml-1；A=1.68×105

7、 X-3.34×104(r=0.9993)，0.023～0.182 mg.ml-1；平均回收率為98.50％(RSD=0.53)，95.30％(RSD=0.32)。市售香連丸中的平均含量為：1.23mg.g-1，1.17 mg.g-1；自制香連丸中的平均含量為：2.41 mg.g-1，2.13 mg.g-1；實驗還對組方藥材-木香中的木香烴內酯和去氫木香內酯進行了含量測定，經測得，其平均含量為：14.93 mg.g-1，13.16 mg

8、.g-1(惠仁堂)；15.67 mg.g-1，11.19 mg.g-1(黃河藥市)；在實驗室所購買的青木香中均未檢測到木香烴內酯和去氫木香內酯。
　　 3.建立了香連丸中生物堿類成分的指紋圖譜測定方法，色譜條件同季胺型生物堿的含量測定。選用藥根堿、巴馬汀和小檗堿為參照物，通過對9批自制及6批市售香連丸的指紋圖譜的分析，共標定了10個共有峰，建立了香連丸指紋圖譜的共有模式。相似度分析表明，在波長350 nm下，15批香連丸的相似度

9、分別為99.80％,99.81％和99.81％(自制)，99.80％,99.82％和99.79％(自制)，99.76％,99.80％和99.81％(自制)，98.15％，98.12％和98.29％(佛慈藥廠)，98.22％，98.24％和98.27％(湖北某藥業(yè)公司)，平均相似度為99.17％。實驗表明，自制與市售香連丸之間，以及自制和市售制劑本身之間具有很好的相關性。在相同的色譜條件下，對黃連藥材進行指紋圖譜分析，并與香連丸的指紋圖譜

10、共有模式進行相似度比較，結果表明，黃連藥材與香連丸有10個峰匹配，且10個匹配峰跟香連丸制劑的共有峰的保留時間和紫外吸收幾乎完全相同，黃連藥材樣品與制劑的相似度在99.51％～99.78％之間，其平均相似度為99.59％，RSD為0.076％。表明各個藥店購買的黃連藥材之間沒有大的差別，黃連在炮制前后跟制劑的相似度無明顯區(qū)別，但炮制的黃連經滲漉后，與制劑的相似度更接近于1，在一定程度上說明制劑所用藥材與我們購買到的黃連藥材品種、來源、質

11、量及處理工藝相似。
　　 以上結果表明所建立的這5種組分的含量測定方法簡便、靈敏、準確，重現性好，不僅可以用于香連丸及制劑藥材中這5種組分的含量測定，而且也為含有黃連和木香藥材的中藥制劑的質量控制提供了方法參考。本實驗采用相似度評價結合藥材與制劑指紋圖譜譜峰匹配及上述的活性組分含量測定等多指標評價的方法，可以用于中藥制劑的質量考察，且方法簡單，重現性好，具有一定的可操作性。
　　 二.木香醇提物中木香烴內酯和去氫木香內酯

12、的藥代動力學及其組織分布研究
　　 1.建立了小鼠血漿中木香烴內酯和去氫木香內酯的HPLC定量分析方法。色譜條件同上述木香烴內酯和去氫木香內酯的含量測定方法，結果表明，兩種成分分離度佳，無內源性物質干擾。方法平均回收率在86.5～101.8％之間，日內及日間精密度的RSD均小于5％，最低檢測限和最低定量限分別為21.27 ng·mL-1和785 ng·mL-1；71ng·mL-1和2.62μg·mL-1。并將該法用于小鼠體內木香

13、提取物中木香烴內酯和去氫木香內酯的藥代動力學研究——昆明小鼠14組(每組6只，每一取血時間點為1組)，單次灌胃給予木香提取物后，于0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0、8.0、12.0、24.0和36.0 h摘眼球取血獲取血漿，以乙腈沉淀蛋白，取上清夜揮干，甲醇復溶定容后進樣分析。灌胃木香醇提物30 min時，血漿中木香烴內酯和去氫木香內酯的峰濃度分別為0.0133和0.0308 mg·mL-1

14、。用Drug And Statistics of Windows1.0(DAS1.0)藥代動力學程序進行模擬，結果顯示木香烴內酯和去氫木香內酯的血藥濃度-時間曲線均符合二室模型，血漿中木香烴內酯和去氫木香內酯的t1/2a和t1/2β分別為0.690和9.908，0.292和11.094 h，相關系數為0.997和0.999，較去氫木香內酯，木香烴內酯吸收較快，而消除較慢。
　　 2.取血后的小鼠頸椎脫臼處死，分離胃、腸、肺、腎、

15、腦、肝和脾等組織(胃及腸用生理鹽水將內容物沖洗干凈)，獲取不同時間點的各組織樣品，精密稱定各臟器組織，加2倍量生理鹽水制成勻漿液，再加4倍量的乙腈旋渦5 min，于4000r.min1離心10 min，取上清液，50℃下氮氣吹干，用500μL甲醇溶解殘渣，用0.45μm微孔濾膜過濾，取上清液20μL。按上述建立的高效液相色譜條件進行測定，木香烴內酯和去氫木香內酯在組織中的最大峰濃度依次為C胃＞C肺＞C腸＞C腎＞C腦，分別為0.108和0

16、.159 mg·g-1；0.069和0.078 mg·g-1；0.010和0.048 mg·g-1；0.0059和0.0069mg·g-1；0.0027和0.0037 mg·g-1，其與血漿峰濃度之比為8.08和5.16；5.17和2.52；0.75和1.56；0.45和0.22；0.20和0.12；在肝臟和脾臟中并未測得上述兩種成分，可能原因為：1.木香烴內酯和去氫木香內酯均為小分子脂溶性化合物，其不經過肝臟代謝，而直接經胃粘膜或腸粘

17、膜被吸收；2.肝臟和脾臟對木香烴內酯和去氫木香內酯的攝取率較低；3.由于脾臟的體積小，樣品的預處理可能會導致其由于其含量低于檢測限而未能檢測到。
　　 研究結果表明這兩種活性組分能較快的分布于各組織中，且在各組織中的最大濃度次序完全相同，依次是胃，肺，腸，腎，腦?？梢妰煞N組分在胃腸中的濃度均較高。這一結論與該藥的治療作用完全吻合。
　　 通過以上研究，為木香烴內酯和去氫木香內酯的作用機理的闡釋建立了理論基礎，也為其臨床應