131I-血管抑素聯(lián)合PcDNA-sTRAIL在荷瘤裸鼠模型腫瘤靶向治療的研究.pdf

1、【目的】
　　腫瘤血管生成與其生長、侵襲和轉移密切相關，抑制血管生成、促進腫瘤細胞凋亡是目前抗腫瘤治療研究的熱點。臨床常用能夠顯著抑制腫瘤血管增生的藥物有血管抑素（AS，Angiostatin）、內(nèi)皮抑素（Endostatin）等，血管抑素重組蛋白現(xiàn)已經(jīng)用于臨床，但是由于生產(chǎn)費用高昂、治療劑量大和需要長期給藥治療等不足，目前不能完全普及。臨床研究表明，內(nèi)皮抑素單獨或聯(lián)合應用具有低毒、低免疫原性和低耐藥性的優(yōu)點，但是有效性尚待考證。

2、因此，尋找有效的聯(lián)合應用血管生成抑制劑的腫瘤治療方案是當今需要解決的難點問題。腫瘤壞死因子相關凋亡配體（TRAIL，Tumor necrosis factor related apoptosis ligand）是目前研究發(fā)現(xiàn)能明顯促進腫瘤細胞凋亡的TNF家族成員。我們假設在腫瘤臨床治療中，如果有效的將抑制腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞凋亡和腫瘤內(nèi)照射的放射療法相結合進行腫瘤靶向治療，可能成為當今的一種新型腫瘤治療方案。本研究通過構建PcDN

3、A3.1-sTRAIL重組表達載體，對其進行擴增、純化，采用放射性同位素131I標記血管抑素（AS）,在荷瘤裸鼠模型中進行PcDNA3.1-sTRAIL與131I-AS聯(lián)合抑瘤實驗。
　　【方法】
　　1．采用親和層析法從人血漿中純化得到纖溶酶原后用彈性蛋白酶進行有限消化得到血管抑素（AS）片段，采取Iodogen固相法將放射性核素131I標記于AS，并測定131I標記產(chǎn)物的標記率、比活度和體外穩(wěn)定性。
　　2．采取T

4、rizol一步法提取總RNA，以提取液作為模板，下游引物引導進行RT反應得到cDNA。然后以cDNA為模板，PCR一步法試劑盒進行擴增反應，獲得目的DNA片段并純化，采用凝膠電泳觀察目的片段sTRAIL的長度，將擴增DNA片段與載體PUCm-T連接，構建T-sTRAIL質(zhì)粒。將T-sTRAIL質(zhì)粒轉入感受態(tài)細菌TGI，用含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆。堿裂解法抽提質(zhì)粒T-sTRAIL，鑒定無誤后將PcDNA3.1和鑒定正確的T-

5、sTRAIL質(zhì)粒分別用EcoRI和BamHI雙酶切并分離純化后，用T4連接酶連接，將連接載體轉入感受態(tài)細菌TGI，Amp抗性的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒并進行酶切并外送鑒定，保存鑒定正確的質(zhì)粒和菌種。最后將PcDNA3.1-sTRAIL轉染293T細胞并利用Western blot進行目標蛋白鑒定。
　　3．構建荷瘤裸鼠模型及SPECT顯像培養(yǎng)A549細胞接種于裸鼠右前肢根部腹側皮下，得到荷瘤裸鼠模型，尾靜脈注射131I-A

6、S0.2 ml，3.7 MBq，分別在2、12、24、48 h進行SPECT顯像。
　　4．聯(lián)合抑瘤作用觀察將32只荷瘤裸鼠隨機分為4組，每組8只，實驗前3天給予含10％碘化鉀飲水進行甲狀腺封閉，瘤內(nèi)注射131I- AS（含131I11.1MBq，AS12.5 mg/kg）加入濃度約為1μg/μl的PcDNA3.1-sTRAIL50μl+Lipofectin50μl、131I-AS（含131I11.1 MBq，AS12.5 mg/

7、kg）、PcDNA3.1-sTRAIL50μl+Lipofectin50μl（濃度為1μg/μl）和生理鹽水0.3 mL，1次/周，連續(xù)四周，動態(tài)觀察28天內(nèi)腫瘤體積的變化并計算抑瘤率，采用游標卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積計算公式：V=W2×L/2（W代表寬度，L代表長度），同時通過HE染色觀察腫瘤組織的形態(tài)變化。
　　【結果】
　　1．L-Lysine Sepharose 4B親和層析法從人血漿中分離并純化得到血管抑素（AS

8、）。Iodogen固相法得到的131I-AS標記率為78.2%~87.7%、比活度為1.31~3.95 TBq/g，將獲得產(chǎn)物于-20℃存放7天觀察其穩(wěn)定性，131I-AS標記物放化純度為原來的70.6%。結果顯示Iodogen固相法所得標記物131I-AS比活度高、性質(zhì)穩(wěn)定。
　　2．采用凝膠電泳觀察目的片段 sTRAIL的長度發(fā)現(xiàn)，與分子質(zhì)量標記比較可見一條特異性條帶大小為723bp左右，和預期大小相符，初步判定重組真核載體的

9、構建成功。Western blot鑒定結果得出蛋白與目的蛋白一致，大小為30.5kD，說明蛋白表達成功。
　　3．SPECT顯像發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域放射性濃度較其他區(qū)域高，說明腫瘤區(qū)域可以特異性攝取血管抑素。
　　4．荷瘤小鼠模型在接受PcDNA-sTRAIL與131I-AS聯(lián)合治療期間腫瘤平均體積與其他各組相比增長緩慢，腫瘤增長抑制明顯。131I-AS+TRAIL組抑瘤率結果較31I-AS組和TRAIL組分別提高了27%和45%。

10、通過SPSS13.0統(tǒng)計學軟件方差分析計算得到，在7、14、21、28天131I-AS+TRAIL治療組、131I-AS組和TRAIL組移植瘤體積相對于生理鹽水組均有非常顯著差異（p＜0.01）。顯微鏡下觀察移植瘤HE染色切片發(fā)現(xiàn)131I-AS＋TRAIL組較131I-AS組、TRAIL組和生理鹽水組的腫瘤細胞壞死明顯，并伴隨不同程度炎細胞浸潤。
　　綜合說明131I-AS和TRAIL聯(lián)合治療方案相比于單獨的TRAIL和131I-