MiR-210在缺氧、氰化物暴露所致PC12細胞損傷效應中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　缺氧環(huán)境會影響機體的正常生理過程,降低人員腦力和體力作業(yè)能力,甚至誘發(fā)急性高原腦水腫和肺水腫、心腦血管缺血性損傷等多種缺氧相關疾病。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的耗氧量最大,表現(xiàn)出對缺氧十分敏感。神經(jīng)系統(tǒng)對于線粒體的依賴使線粒體障礙成為造成神經(jīng)系統(tǒng)異常的重要因素。研究表明,缺氧能夠影響多種miRNA表達,其中以miR-210的高水平表達穩(wěn)定且顯著。與線粒體密切相關的ISCU1/2和COX10蛋白正是miR-210的靶基因。本研

2、究以原始神經(jīng)細胞系PC12細胞、16HBE支氣管上皮細胞、HUVEC人臍靜脈內皮細胞作為缺氧模型,比較缺氧對不同來源組織細胞作用的差異,重點觀察缺氧、氰化物對神經(jīng)細胞存活的影響及其可能機制,研究miR-210在神經(jīng)細胞中的表達、調控細胞應對細胞內和細胞外缺氧的相關機制以及對線粒體功能的影響。
　　研究內容:
　　PC12細胞、16HBE細胞、HUVEC細胞進行1％O2缺氧暴露,實驗組分為缺氧12h組、缺氧24h組、缺氧48h

3、組。觀察缺氧暴露對于PC12細胞、16HBE細胞、HUVEC細胞形態(tài)的改變。利用CCK-8法檢測缺氧暴露后細胞存活率的變化。采用qRT-PCR方法檢測miR-210在缺氧暴露后的動態(tài)表達變化。采用miR-210mimic和miR-210 inhibitor轉染PC12細胞,驗證在缺氧情況下miR-210對神經(jīng)細胞的保護作用。
　　利用流式細胞儀測定缺氧暴露后PC12細胞線粒體膜電位的變化。高效液相色譜法(HPLC)測定缺氧暴露后P

4、C12細胞中ATP、ADP和AMP的含量,反映缺氧后線粒體功能的改變。用Western blot測定PC12細胞缺氧暴露后線粒體相關蛋白ISCU和COX10的表達情況,反映缺氧對線粒體呼吸鏈的影響。
　　氰化鈉染毒PC12細胞,觀察細胞形態(tài)改變并且利用MTT法檢測細胞毒性。采用qRT-PCR方法檢測miR-210在氰化鈉染毒后表達的變化。用Western blot測定PC12細胞線粒體相關蛋白ISCU和COX10的表達情況,比較細

5、胞內缺氧與環(huán)境缺氧的區(qū)別。
　　研究結果:
　　缺氧暴露不同程度地降低了PC12細胞、16HBE細胞、HUVEC細胞存活率,其中缺氧24h組和48h組的細胞存活率顯著低于正常對照組。PC12細胞缺氧暴露12小時后,胞體腫脹;缺氧暴露24小時后,PC12細胞密度降低,折光性下降,細胞突觸變短和減少,由多角形細胞為主向雙極細胞為主轉變。16HBE細胞缺氧暴露24小時細胞出現(xiàn)固縮,細胞密度降低。HUVEC細胞缺氧暴露24小時后,細

6、胞密度降低,邊界模糊,折光率下降。在缺氧暴露48小時后三種細胞死亡數(shù)量明顯增多。
　　利用Rhodamine123和高效液相色譜法的檢測結果表現(xiàn)出PC12細胞缺氧組較對照組線粒體膜電位下降,線粒體內ATP含量顯著降低,而ADP、AMP含量顯著升高,提示線粒體呼吸調節(jié)功能、氧化磷酸化偶聯(lián)在缺氧作用下發(fā)生了嚴重障礙,線粒體內膜的ATP合酶復合體受到抑制,導致了ATP合成效率降低,進一步加劇了線粒體ATP含量的下降。
　　用qRT

7、-PCR方法檢測出缺氧暴露后miR-210的表達顯著升高,16HBE細胞反應早而強烈(12h開始即達最強水平),PC12細胞反應逐漸加強(48h達到最強水平),HUVEC細胞中等程度升高(12-24h)。Western blot結果提示ISCU和COX10作為miR-210的靶基因,其表達顯著降低,與缺氧暴露存在著時間-效應關系。
　　在PC12細胞中過表達或抑制miR-210后,miR-210mimic24h組和48h組存活率顯

8、著增加,而miR-210 inhibitor各組存活率均顯著下降,表明在缺氧情況下miR-210對于PC12細胞具有保護作用。
　　氰化鈉染毒PC12細胞氰化鈉濃度為1mM時miR-210顯著升高。MiR-210靶基因ISCU1/2和COX10蛋白的表達相應降低,結果顯示出細胞內缺氧與環(huán)境缺氧的一致性。
　　研究結論:
　　根據(jù)以上研究結果,得出結論如下:
　　本研究首次比較了缺氧誘導不同組織來源細胞表達miR-

9、210的作用特點,呼吸道上皮細胞反應早而強烈(12h開始即達最強水平),神經(jīng)組織細胞反應逐漸加強(48h達到最強水平),血管內皮細胞中等程度升高(12-24h)。
　　缺氧環(huán)境能顯著抑制PC12細胞、16HBE細胞、HUVEC細胞增殖,缺氧誘導的miR-210表達對神經(jīng)細胞具有保護作用。
　　缺氧導致PC12細胞線粒體功能嚴重障礙,降低線粒體膜電位,影響線粒體ATP合成率。
　　缺氧誘導的miR-210通過調控其靶基因