天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導A549細胞上皮間質轉化過程以及對微小RNA表達的影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　特發(fā)性肺纖維化(IPF)為原因不明并以普通型間質性肺炎(UIP)為特征性的病理改變的一種慢性纖維化性間質性肺疾病,預后不良,無有效治療藥物,其具體的發(fā)病機制尚未完全明確。肺泡上皮細胞-間充質細胞轉分化(Epithelial-mesenchymal Transitionn,EMT)是肺間質纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié),是決定肺間質纖維化程度的關鍵因素。實驗前期我們采用了肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549細胞)開展了天龍咳喘

2、靈提取物干預肺泡上皮EMT的研究,結果證明:天龍咳喘靈提取物不僅能有效阻止甚至能夠逆轉肺泡上皮EMT。
　　microRNA(miRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的長約22nt(核苷酸)的非編碼小RNA分子,其廣泛存在于真核生物體內,人類基因有近1/3受其調控。已有研究證明,部分miRNA參與了肺間質纖維化的發(fā)生發(fā)展,特定的miRNA有望成為肺間質纖維化治療的新靶點。天龍咳喘靈是廣東省名中醫(yī)邱志楠教授的經驗方,成方主要由熟附子、青天葵、法半

3、夏、款冬花、五味子等十味中草藥材組成。臨床長期用于治療喘息型慢性支氣管炎、肺間質纖維化、哮喘等,療效明確且無毒副反應。為此,我們進一步采用miRNA芯片技術,觀察天龍咳喘靈提取物抑制轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的肺泡上皮細胞EMT時miRNA表達譜的變化,為進一步研究miRNA在肺泡上皮細胞EMT中的生物學作用提供了實驗依據(jù)。
　　研究內容和方法:
　　第一部分:天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導的A549細胞E

4、MT過程
　　1.采用MTT法檢測天龍咳喘靈提取物對A549細胞增殖的影響,觀察其劑量和時間的相互依賴性。
　　2.模擬體內炎癥微環(huán)境,體外培養(yǎng)A549細胞,天龍咳喘靈提取物和/或TGF-β1刺激A549細胞后,應用相差顯微鏡觀察A549細胞形態(tài)學變化。
　　3.RT-PCR、Western blot法檢測EMT相關標記蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白水平的表達變化,研究天龍咳喘靈提取物對TGF-β1

5、誘導的A549細胞EMT的影響。
　　第二部分:miRNA在天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT時的表達變化
　　1.體外培養(yǎng)A549細胞,天龍咳喘靈提取物和/或TGF-β1刺激A549細胞后,提取其總RNA,檢測RNA的純度和完整性。
　　2.應用miRNA芯片技術檢測天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT過程miRNA表達的變化。
　　3.應用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(

6、RT-PCR)驗證芯片結果的可靠性。
　　結果:
　　第一部分:天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT過程
　　1.復方天龍咳喘靈提取物濃度在50μg/ml以上時,24h、48h、72h各時間點均呈現(xiàn)對A549細胞增殖的抑制效應。
　　2.TGF-β1與A549共培養(yǎng)48h后顯微鏡下觀察,可見與對照組A549細胞比較,經TGF-β15ng/ml刺激后,大部分細胞呈現(xiàn)出梭狀成纖維細胞形態(tài),而在同時

7、添加天龍咳喘靈提取物50μg/ml的A549細胞,上述梭狀成纖維形態(tài)細胞較前明顯較少,形態(tài)改變呈逆轉趨勢。
　　3.RT-PCR、Western blot結果顯示TGF-β15ng/ml可以誘導EMT相關標記蛋白α-SMA表達的明顯上調,而加入天龍咳喘靈提取物50μg/ml時可以明顯抑制這種表達的上調。
　　第二部分:微小RNA(miRNA)在天龍咳喘靈提取物抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT時的表達變化
　　1

8、.核酸檢測儀檢測3組樣本總RNA的OD260/OD280值均在1.8-2.0之間,瓊脂糖凝膠電泳可觀察到18S與28SrRNA兩條清晰條帶,且亮度之比接近1:2。
　　2.芯片掃描獲得誘導前后miRNA差異表達譜,采用custom error model(美國Illumina產品)進行差異基因分析,篩選出210個detection p-value≦0.05miRNA。分析樣本間miRNA表達量的變化,識別出組間差異表達miRNA,

9、提取數(shù)據(jù)進行歸一化處理,篩選出2倍以上差異表達的miRNA共81個,其中與空白對照組比較,TGF-β1組有41種miRNA的表達出現(xiàn)顯著改變,其中26種表達上調2倍以上,15種表達下調2倍以上;天龍咳喘靈提取物抑制組,有46種miRNA的表達出現(xiàn)顯著變化,其中25種表達上調2倍以上,21種表達下調2倍以上;并且有17種miRNA表達在兩組同時出現(xiàn)顯著改變,其中在TGF-β1組明顯上調而在天龍咳喘靈提取物抑制組明顯下調13種,在TGF-β

10、1組明顯下調而在天龍咳喘靈提取物抑制組明顯上調4種。其中包括mir-29a-3p、mir-29b-3p等在TGF-β1組下調而在天龍組上調;mir-139-3p在TGF-β1組上調而在天龍組下調。
　　3.為驗證芯片表達譜結果的準確性,挑選miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-139-3p做熒光定量RT-PCR實驗,檢測結果為,和空白對照組比較:mir-29a-3p在TGF-β1組下調47.67％、天龍組上調79.1

11、9%;mir-29b-3p在TGF-β1組下調25.86%、天龍組上調150.69%;mir-139-3p在TGF-β1組上調74.17%、天龍組下調40.01%。結果基本與芯片表達譜結果一致。
　　結論:
　　1.復方天龍咳喘靈提取物能夠抑制甚至逆轉TGF-β1誘導的A549細胞EMT,EMT是纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié),提示其在抗纖維化藥物治療上的潛在應用價值。
　　2、miRNA表達的上調/下調與天龍咳喘靈抑制/逆