提高腺病毒對(duì)豬皮膚組織轉(zhuǎn)染效率的研究.pdf

1、基因轉(zhuǎn)染豬皮是由腺病毒載體介導(dǎo)CTLA41g基因轉(zhuǎn)染活性豬皮膚組織而成，其移植于受體創(chuàng)面后，可在移植局部分泌CTLA41g蛋白，有效阻斷T細(xì)胞活化所需的B7-CD28共刺激信號(hào)通道，從而抑制T細(xì)胞活化，形成移植局部免疫耐受，延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間，有效延緩了異種皮膚移植免疫排斥發(fā)生，同時(shí)避免了使用常規(guī)免疫抑制劑對(duì)免疫功能脆弱的大面積燒傷病人造成的副作用，是臨床理想的活性生物敷料。但由于常用的5型腺病毒載體(Ad5)對(duì)豬皮膚組織的轉(zhuǎn)染效率相對(duì)

2、較低，需要進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率以提高治療效果。 基因轉(zhuǎn)染效率是基因治療的核心和關(guān)鍵，是當(dāng)前基因治療研究的熱點(diǎn)。由于豬的皮膚組織結(jié)構(gòu)十分致密，因此病毒載體的轉(zhuǎn)染效率較低。為了達(dá)到足夠的轉(zhuǎn)染效果，需要使用較高滴度的重組腺病毒載體和較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染時(shí)間，而較高的滴度長(zhǎng)時(shí)間作用存在負(fù)作用，同時(shí)當(dāng)?shù)味冗_(dá)到一個(gè)閾值后，其轉(zhuǎn)染效率不再發(fā)生明顯的變化，因此在控制腺病毒滴度的前提下提高腺病毒載體對(duì)豬皮膚組織的轉(zhuǎn)染效率不僅對(duì)于研制基因轉(zhuǎn)染豬皮具有重要的意義

3、，而且對(duì)皮膚基因治療也具有重要的借鑒和參考作用。 腺病毒對(duì)皮膚組織的轉(zhuǎn)染過(guò)程大致可分為三個(gè)階段，每個(gè)階段都會(huì)有居多因素影響腺病毒的轉(zhuǎn)染效率。第一階段：腺病毒通過(guò)表皮屏障到達(dá)皮膚細(xì)胞周?chē)?。在這一階段，由于表皮組織十分致密，影響腺病毒載體進(jìn)入到皮膚組織內(nèi)部，到達(dá)皮膚細(xì)胞的周?chē)?，從而影響轉(zhuǎn)染效率；第二階段：腺病毒載體與皮膚細(xì)胞互相接觸。在此階段，由于細(xì)胞表面和腺病毒載體的表面均攜帶負(fù)電荷，存在靜電排斥作用，影響腺病毒與皮膚細(xì)胞互相接觸

4、，從而影響轉(zhuǎn)染效率：第三階段：腺病毒載體通過(guò)與皮膚細(xì)胞表面的CAR受體相互作用，以胞吞的形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，完成對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染的第三階段，由于豬皮膚細(xì)胞表面的CAR受體較少，影響了腺病毒載體對(duì)豬皮膚組織的轉(zhuǎn)染效率。 本課題針對(duì)影響腺病毒載體轉(zhuǎn)染豬皮膚組織的以上三個(gè)限制性原因，分三個(gè)部分對(duì)提高腺病毒載體轉(zhuǎn)染豬皮膚組織的效率進(jìn)行研究。通過(guò)定量PCR、ELISA、皮膚活性檢測(cè)、體外淋巴刺激實(shí)驗(yàn)、移植試驗(yàn)等方法從基因、蛋白和功能三個(gè)層

5、次進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果的評(píng)估。以降低基因轉(zhuǎn)染豬皮的腺病毒用量，縮短轉(zhuǎn)染時(shí)間，提高腺病毒載體對(duì)豬皮膚組織的轉(zhuǎn)染效率。 第一部分：針對(duì)豬皮膚細(xì)胞表面的CAR受體較少的問(wèn)題，構(gòu)建利用在各類(lèi)細(xì)胞表面均有廣泛表達(dá)的CD46分子為受體進(jìn)行感染的新型嵌合型腺病毒載體Ad5F35-CTLA4Ig，與傳統(tǒng)的腺病毒載體Ad5-CTLA4Ig進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果的比較。結(jié)果表明：Ad5F35的最佳轉(zhuǎn)染條件是在滴度為5×108條件下轉(zhuǎn)染60分鐘，其次是在3×108條件

6、下轉(zhuǎn)染120分鐘，在此條件下，Ad5F35的轉(zhuǎn)染效率分別是Ad5的1.49倍和1.73倍，表明Ad5F35-CTLA4Ig對(duì)豬皮膚組織的轉(zhuǎn)染效率要優(yōu)于Ad5-CTLA4Ig。但較高的病毒滴度長(zhǎng)時(shí)間對(duì)豬皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)染存在負(fù)作用，因此我們選擇Ad5F35-CTLA4Ig作為基因轉(zhuǎn)染豬皮的病毒載體進(jìn)行后續(xù)研究。 第二部分：針對(duì)皮膚細(xì)胞表面負(fù)電荷與腺病毒載體表面負(fù)電荷產(chǎn)生的靜電排斥作用，分別將不同的陽(yáng)離子物質(zhì)(DEAE-dextran

7、，protamine，Hexadimethrine bromide)在體外對(duì)腺病毒載體進(jìn)行處理，在腺病毒載體衣殼外形成一層正電荷層，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染效果的研究，以降低腺病毒載體的轉(zhuǎn)染用量，減少高的病毒滴度對(duì)豬皮膚組織進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間轉(zhuǎn)染造成的負(fù)作用。結(jié)果表明：三種陽(yáng)離子均能有效提高腺病毒轉(zhuǎn)染效率，其中500μg/mL的DEAE-dextran效果最為明顯，可將108PFU/mL Ad5F35-CTLA4Ig轉(zhuǎn)染2小時(shí)的效率提高19.3倍。

8、 第三部分：針對(duì)腺病毒難以通過(guò)表皮屏障達(dá)到皮膚細(xì)胞周?chē)膯?wèn)題，在病毒載體轉(zhuǎn)染液中添加皮膚促滲劑氮酮，同時(shí)結(jié)合活性皮膚轉(zhuǎn)染后需要抗凍處理，然后進(jìn)行深低溫凍存以長(zhǎng)期保持皮膚活性的情況，將轉(zhuǎn)染和抗凍兩步合二為一，以縮短轉(zhuǎn)染時(shí)間。結(jié)果表明：1％的氮酮作用60分鐘時(shí)效果最好，可將轉(zhuǎn)染效率提高2.9倍。在此條件下加入500μg/mL的DEAE-dextran至轉(zhuǎn)染抗凍液中，可將轉(zhuǎn)染效率提高10.2倍，同時(shí)皮膚活力與對(duì)照組無(wú)明顯差異，且效果要優(yōu)于對(duì)照

9、組。 結(jié)論：使用Ad5F35-CTLA4Ig作為病毒載體，將轉(zhuǎn)染和抗凍合二為一，在轉(zhuǎn)染液中添加1％的氮酮和500μg/mL的DEAE-dextran，可減少處理時(shí)間1.5小時(shí)，提高轉(zhuǎn)染效率10.2倍，且用此方法生產(chǎn)的基因轉(zhuǎn)染豬皮的效果要優(yōu)于常規(guī)生產(chǎn)的基因轉(zhuǎn)染豬皮。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1)通過(guò)綜合處理，在不提高腺病毒滴度的情況下，將腺病毒對(duì)豬皮膚組織的轉(zhuǎn)染效率提高了10.2倍，同時(shí)減少了處理時(shí)間90分鐘。 2)首次