乙肝患者肝移植術中紅細胞回收與病毒滅活后紅細胞功能的研究.pdf

1、乙型肝炎是人類面對的最常見的疾病之一，已成為僅次于心腦血管病和惡性腫瘤的重大疾病，對人類危害極大。肝移植是治療終末期乙肝患者的最有效手段。肝移植手術創(chuàng)傷大，技術復雜，手術時間長，加之患者凝血功能低下，術中出血量大，圍術期需要輸注大量異體血。這與血源供應不足，臨床用血緊張相矛盾，對血源的供應將是一個重大的挑戰(zhàn)。如果不能很好的解決這一問題，將在一定程度上限制肝移植的發(fā)展。自體血回收能即刻提供完全相容、常溫的同型血液，能避免異體輸血傳播血源性

2、疾病的危險，幾乎杜絕了異體輸血后出現(xiàn)的發(fā)熱反應、過敏反應、溶血反應和移植物抗宿主病等不良反應。 肝移植術后肝炎復發(fā)是影響此類患者肝移植成功的重要因素?；厥盏淖泽w血經(jīng)過病毒滅活處理后再回輸，盡可能減少患者血液循環(huán)中乙肝病毒滴度，則有可能給降低肝移植術后肝炎復發(fā)創(chuàng)造良好條件，提高肝移植的成功率。目前，在臨床上洗滌回收式自體輸血占主流，將術野的出血經(jīng)過收集、過濾、加工后作為洗滌紅細胞回輸，能回收患者失血量約90％的紅細胞，回收血中紅細

3、胞濃度較高(Hct≥50％)，并清除了創(chuàng)面的組織碎片、游離血紅蛋白、激活凝血因子、術野混進的脂肪細胞及抗凝劑等，避免了非洗滌式回收的嚴重并發(fā)癥。光化學滅活法能有效地滅活血液制品中人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病原體。所用的光敏劑包括亞甲藍(MB)和核黃素(RF)等。光化學法的原理是利用血液有效成分中不含核酸，而光敏劑在特定 光線作用下能介導核酸骨架鏈斷裂，達到徹底滅活病毒的目的。在乙肝肝移植術中使用自體血液回收與

4、病毒滅活后回輸技術，將為肝移植圍術期的臨床輸血提供一種嶄新的思路：既達到節(jié)約大量血液，緩解目前普遍存在的用血緊張的狀況；又能使肝移植患者盡量避免輸注異體血，減少輸血不良反應，為術后恢復創(chuàng)造良好條件;同時減輕患者的經(jīng)濟負擔，具有廣闊的應用前景。 研究目的： 1、研究乙肝患者肝移植術中自體血液回收對紅細胞的形態(tài)、結構及生理功能的影響。 2、使用亞甲藍光化學法(MBP)及核黃素光化學法(RFP)對乙肝病毒進行滅活，評價

5、兩種方法對乙肝病毒的滅活效果。 3、研究亞甲藍光化學法及核黃素光化學法對紅細胞的形態(tài)、結構及生理功能的影響，確定可供臨床使用的乙肝病毒滅活方法。 材料與方法： 1、材料 1.1標本來源 乙肝肝移植病人術前靜脈血及術中回收血標本(15例)，高滴度乙肝病毒病人靜脈血標本(15例)。 1.2材料 DNA提取試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒、核黃素、亞甲藍、FITC標記兔抗鼠

6、IgG(H+L)、抗HBV Pre-S抗原鼠單克隆抗體、DNA凝膠回收試劑盒、2，3-DPG測定試劑盒、超微量ATP酶測試盒、丙二醛測定試劑盒、DNA分子量標準、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、游離血紅蛋白測試盒、蛋白質(zhì)分子量標準、Premix Taq酶、瓊脂糖、高氯酸、30％Acr(丙烯酰胺)單體貯液、1.5M Tris-HCl(PH8.8)、0.5M Tris—HCl(PH6.8)、10％SDS、1096過硫酸銨、染色液、脫色液、丙二醛固

7、定液、DNA mark、溴化乙錠等。 2、方法 2.1隨機選擇行乙肝肝移植患者，行氣管內(nèi)全麻，維持適宜的麻醉深度，收集術前靜脈血及術中回收血標本(以下簡稱回收前后血標本)，檢測紅細胞的形態(tài)、結構與生理功能。 2.1.1紅細胞形態(tài)結構檢測 應用全自動血液分析儀檢測紅細胞MCV、MCH、MCHC、RDW-SD及RDW-CV，在倒置顯微鏡下行紅細胞形態(tài)學計分，掃描電鏡下觀察紅細胞表面超微結構，采用SDS-PAG

8、E對紅細胞膜骨架蛋白進行分析。 2.1.2紅細胞生理功能檢測 按照試劑盒說明書，檢測回收前后紅細胞2，3-DPG濃度，血漿游離血紅蛋白(FHb)含量，紅細胞膜Na+一K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性，丙二醛(MDA)含量，采用氯化鈉磷酸緩沖液梯度稀釋法檢測紅細胞滲透脆性。 2.1.3血液流變學檢測 用流變儀檢測各樣本流變學指標：全血低、中、高切粘度，血漿粘度，血液相對粘度，紅細胞

9、聚集指數(shù)，卡松粘度及屈服應力。 2.2隨機抽取高滴度乙肝病毒病人靜脈血標本，用亞甲藍光化學法及核黃素光化學法對乙肝病毒進行滅活，評價兩種方法對乙肝病毒的滅活效果。 2.2.1亞甲藍光化學法：分別以5、20、40、80μmol/L的終濃度，可見冷光3.5萬～4萬1ux的強度照射30分鐘、1小時和1.5小時。 2.2.2核黃素光化學法：分別以50、200、400、1200，1600 μmol/L的終濃度，UVA 20

10、焦耳/cm2的強度照射30分鐘、1.5小時和2小時。 2.2.3按試劑盒說明書提取滅活前后全血標本DNA，以乙肝病毒C基因為目的基因設計引物，在到達平臺期前結束PCR反應，對C基因表達進行相對定量。 2.2.4按試劑盒說明書操作，采用特異性探針實時熒光定量PER(RT-PCR)檢測全血標本中HBV DNA拷貝數(shù)。 2.3采用流氏細胞術，以抗HBV Pre-S抗原鼠單克隆抗體為一抗，以FITC標記兔抗鼠IgG為二抗

11、，檢測乙肝病人紅細胞表面乙肝病毒的表達情況。 2.4對病毒滅活前后血標本進行紅細胞的形態(tài)、結構與生理功能檢測，確定可供臨床使用的乙肝病毒滅活方法(具體方法同上述2.1) 3、統(tǒng)計學處理 SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用χ-±s表示，標本處理前后各指標比較采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 一、紅細胞形態(tài)結構檢測結果 1、乙肝肝移植術中血液回收前后紅細胞形態(tài)學

12、觀察 紅細胞形態(tài)學計分有增多的趨勢，但仍在正常范圍內(nèi)，回收前后無統(tǒng)計學差別。MCV、MCH、MCHC、RDW-SD及RDW-CV無統(tǒng)計學差別。 2、乙肝病毒滅活前后紅細胞形態(tài)學觀察 病毒滅活前后紅細胞形態(tài)學計分、MCV、MCH、MCHC、RDW-SD及RDW-CV均無統(tǒng)計學差別。 3、掃描電鏡下觀察紅細胞超微結構 回收血液中偶爾出現(xiàn)不規(guī)則棘形紅細胞;核黃素光化學法滅活后偶爾出現(xiàn)異常突起紅細胞;而亞

13、甲藍光化學法滅活后，偶爾出現(xiàn)皺褶紅細胞。 4、SDS-PAGE分析紅細胞膜骨架蛋白 帶3蛋白及其他蛋白與帶3蛋白的比例在自體血液回收前后及病毒滅活前后無統(tǒng)計學差別。 二、紅細胞生理功能檢測結果 術野回收血比起術前靜脈血，F(xiàn)Hb明顯增高(P<0.05)，2，3-DPG、Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、MDA和滲透脆性均無明顯變化(P>0.05)。 核黃素光化

14、學法滅活后比起滅活前靜脈血，Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase明顯降低，MDA明顯增高(P<0.05)，而2，3-DPG、FHb和滲透脆性無明顯變化(P>0.05)。 亞甲藍光化學法滅活后比起滅活前靜脈血，MDA明顯增高(P<0.05)，2，3-DPG、Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、FHb和滲透脆性均無明顯變化(P>0.05)。 三、流變學

15、檢測結果 用流變儀檢測各樣本流變學指標，測得術中回收血與術前靜脈血比較：中、高切粘度明顯降低，卡松粘度明顯增高;全血低切粘度、血漿粘度、血液相對粘度、紅細胞聚集指數(shù)及屈服應力無明顯變化(P>0.05)。 核黃素光化學法滅活后與滅活前靜脈血比較，全血低切粘度、血液相對粘度明顯降低(P<0.05)，其他流變學指標均無明顯變化(P>0.05)。亞甲藍光化學法滅活后與滅活前靜脈血比較，除屈服應力明顯增大外(P<0.05)，其他均

16、無明顯變化(P>0.05)。 四、流氏細胞術檢測到紅細胞表面無乙肝病毒的表達。 五、病毒滅活效果檢測 1、HBV C基因擴增產(chǎn)物與GenBank所公布的HBV C基因序列有較好的一致性。 2、以1600uM核黃素滅活2h及以80uM亞甲藍滅活1.5h后，HBV C基因擴增條帶明顯減弱，亞甲藍光化學法滅活后HBV DNA拷貝數(shù)明顯減少(P<0.05)，而核黃素光化學法滅活效果不明顯(P>0.05)。

17、 結論： 1、乙肝肝移植病人術中自體血液回收前后紅細胞形態(tài)、結構及生理功能未受明顯影響，部分流變學指標在回收前后有統(tǒng)計學差異。 2、通過流氏細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，紅細胞表面無乙肝病毒表達。 3、核黃素光化學法對乙肝病毒滅活效果不明顯，對紅細胞生理功能和流變學有一定影響。該方法的各滅活參數(shù)和條件有待進一步探討和優(yōu)化。 4、亞甲藍光化學在較低終濃度較短時間內(nèi)即能較明顯滅活乙肝病毒，對紅細胞形態(tài)結構及功能無明顯影響。