人CD4和HLA-DR0401表達載體的轉(zhuǎn)化擴增及其在L929細胞中的表達.pdf

1、目的與意義: 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性進行性的自身免疫性疾病。由于RA發(fā)病機制未明，目前尚無令人滿意的具有確切療效且毒副作用小的藥物。為了進一步探討RA的病因、病理、免疫學(xué)、臨床等方面的機制，以及尋找更有效的治療RA的方案，建立良好的RA動物模型是當(dāng)務(wù)之急。當(dāng)前應(yīng)用于RA研究的動物模型主要有誘導(dǎo)性，自身免疫性和移植型動物模型，其中研究最多的是膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎。然而，RA是由遺傳、感

2、染、環(huán)境、免疫等多種復(fù)雜因素共同作用而致，而RA動物模型只是側(cè)重于某一個或某幾個因素而建立起來的，沒有一種模型能夠完全模擬人RA狀況。目前選用的RA動物模型在發(fā)病機制方面與人RA存在差別，所以選擇與人RA發(fā)病機制及病理相同或相似的動物模型在RA研究中的作用也就越來越重要了。 轉(zhuǎn)基因動物是指用實驗導(dǎo)入的方法使外源基因在動物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，并能遺傳給后代的一類動物。當(dāng)外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)表達，并培育出其表型與人類疾病癥狀

3、相似的動物模型，則稱其為轉(zhuǎn)基因動物模型。國內(nèi)外已建立了幾種RA轉(zhuǎn)基因鼠模型，這種模型產(chǎn)生疾病的原因清楚(由轉(zhuǎn)入的外源基因引起)，模型動物的癥狀單一，接近于病人的癥狀。因此，轉(zhuǎn)基因鼠動物模型的開發(fā)成為建立RA動物模型熱點。 目前RA相關(guān)基因轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建還在起步階段，絕大多數(shù)的實驗室仍采用最經(jīng)典的顯微注射法。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鼠動物模型需要耗費大量的人力物力，因此必須作好完善的前期準備。其中，外源基因的結(jié)構(gòu)和質(zhì)量是轉(zhuǎn)基因成功的必要條件之

4、一。用于轉(zhuǎn)基因的外源基因除了本身基因的特性和表達某一臨床特征外，必須在轉(zhuǎn)入動物體后能自身表達，并且可通過某種方法鑒定出來，因此首先研究外源基因能否在體外細胞表達顯得尤為重要。 二十幾年來國內(nèi)外已經(jīng)有一些學(xué)者開展了HLAII類分子轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞的研究，并取得了一些成果。我們擬將HLA-DR0401和人CD4基因轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細胞系L929中。HLA-DR0401在RA發(fā)病中起主要遺傳作用，CD4分子是主要組織相容性復(fù)合體II

5、類(majorhistocompatibilitycomplexII，MHCII)分子的共受體。研究表明，RA發(fā)病與CD4+T細胞有密切關(guān)系，CD4抗原與抗原提呈細胞(APC)提呈的抗原多肽結(jié)合，能提高攝取HLA-DR抗原的能力。本研究的目的是轉(zhuǎn)化和擴增人CD4和HLA-DR0401載體，并使其在小鼠成纖維細胞系L929中得到表達，為下一步RA轉(zhuǎn)基因鼠模型的構(gòu)建奠定實驗基礎(chǔ)。 二、方法與內(nèi)容: 1.pcDNA3-CD4和

6、pLNCX2-DR*0401的轉(zhuǎn)化、擴增 取DH5α感受態(tài)菌置于冰浴中，向感受態(tài)細胞懸液中加入1μl的質(zhì)粒，混勻后在冰浴中靜置30min，再經(jīng)42℃水浴90s后迅速置冰浴中2min。在上述體系中加入500μl的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩(150rpm)培養(yǎng)45min。取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，置平皿于室溫直至液體被吸收，倒置平皿，37℃培養(yǎng)12-16小時。挑取菌落進行擴大培養(yǎng)后，按

7、質(zhì)粒提取試劑盒的說明操作，進行質(zhì)粒的抽提。 2.pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401的鑒定 根據(jù)質(zhì)粒圖譜，先用限制性內(nèi)切酶雙酶切進行質(zhì)粒的初步鑒定，再將質(zhì)粒pcDNA3-CD4送廣州Invitrogen公司進行序列測定，將質(zhì)粒pLNCX2-DR*0401送大連TaKaRa公司進行序列測定。 3.L929細胞株的培養(yǎng)、傳代 L929細胞用含有RPMI1640+10％小牛血清+1％雙抗的完全培養(yǎng)

8、基培養(yǎng)，傳代時用胰蛋白酶-EDTA液將處于對數(shù)生長期的細胞從瓶壁上消化下來。加新鮮培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，然后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每天換液，傳代時間一般為兩天。 4.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染L929細胞 轉(zhuǎn)染過程依照LipofectamilienTK脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行，并對具體條件進行優(yōu)化。具體如下：轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期的L929細胞消化傳代，以4×105/mL的細胞密度，1mL的量接種于6孔板中。細胞生長匯片至90％時，將pc

9、DNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401分別與脂質(zhì)體以1:3的比例混合，無血清培養(yǎng)基孵育20min后加入到培養(yǎng)的L929細胞上。培養(yǎng)6h后，換為含20％胎牛血清的1640的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。 5.人CD4和HLA-DR0401在L929細胞中的表達和鑒定 (1)流式細胞術(shù)測定 收集1×106個轉(zhuǎn)染細胞，4℃以上冷PBS洗一次，100μlPBS懸浮細胞，分別加入20μlFITC標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體(RP

10、A-T4)和PE標(biāo)記的抗人HLA-DR單克隆抗體(LN3)，4℃避光孵育1h，用PBS洗細胞兩次，用200μlPBS懸浮細胞后送測。 (2)直接免疫熒光測定 轉(zhuǎn)染細胞爬片，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗片3次，干燥后分別加入20μlFITC標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體(RPA-T4)和PE標(biāo)記的抗人HLA-DR單克隆抗體(LN3)，4℃濕盒避光孵育過夜。PBS洗片3次后50％甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。 三、

11、結(jié)果與分析: 1.擴增質(zhì)粒的純度和濃度 經(jīng)轉(zhuǎn)化和克隆篩選，提取的pcDNA3-CD4質(zhì)粒其A260/A280比值為1.86，濃度為474ng/μl，pLNCX2-DR*0401質(zhì)粒其A260/A280比值為1.90，濃度為182ng/μl，說明經(jīng)轉(zhuǎn)化后獲得質(zhì)粒純度高，質(zhì)量好。 2.pcDNA3一CD4和pLNCX2-DR*0401的鑒定 (1)pcDNA3-CD4的酶切及測序鑒定結(jié)果 質(zhì)粒pcDN

12、A3-CD4經(jīng)單酶切后產(chǎn)生一條長約8.5kb的片段；按照質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖，經(jīng)NruI和PinAI雙酶切，產(chǎn)生兩條片段，分別為2250bp和6221bp。酶切鑒定正確，對質(zhì)粒pcDNA3-CD4進行序列分析，將測定序列與GenBank登錄的CD4基因(NM-000616)序列進行比較，證明測定序列完全正確。 (2)pLNCX2-DR*0401的酶切及測序鑒定結(jié)果 質(zhì)粒pLNCX2-DR*0401經(jīng)單酶切后產(chǎn)生一條長約8.3kb的

13、片段；按照質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖，經(jīng)BglII和NotI雙酶切，產(chǎn)生兩條片段，分別為2233bp和6102bp。酶切鑒定正確，對質(zhì)粒pLNCX2-DR*0401進行序列分析，將測定序列與GenBank登錄的HLA-DRα基因(NM-019111)序列進行比較，證明測定序列完全正確。從反向設(shè)計測定HLA-DRβ1序列時，因樣品存在高級結(jié)構(gòu)，測序終止。 3.L929細胞株的培養(yǎng)、傳代 L929細胞生長狀態(tài)良好，呈梭形、大多角形或扁平星形

14、。 4.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染L929細胞 轉(zhuǎn)染48h后，約5％細胞死亡，細胞形態(tài)與轉(zhuǎn)染前比較無明顯變化。 5.人CD4轉(zhuǎn)染細胞流式細胞術(shù)的檢測 采用FITC標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體(RPA-T4)對人CD4蛋白在轉(zhuǎn)染后的L929細胞中的表達做測定，以轉(zhuǎn)染了pcDNA3-CD4質(zhì)粒但未加抗體的L929細胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒但加了抗體的L929細胞做對照。結(jié)果顯示對照組未檢出熒光標(biāo)記陽性的細胞，而轉(zhuǎn)染了人CD4質(zhì)粒的L9

15、29細胞中有61％的細胞為熒光標(biāo)記陽性。 6.HLA-DR0401轉(zhuǎn)染細胞流式細胞術(shù)的檢測 采用PE標(biāo)記的抗人HLA-DR單克隆抗體(LN3)對HLA-DR0401蛋白在轉(zhuǎn)染后的L929細胞中的表達做測定，以轉(zhuǎn)染了pLNCX2-DR*0401質(zhì)粒但未加抗體的L929細胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒但加了抗體的L929細胞做對照。結(jié)果顯示對照組未檢出熒光標(biāo)記陽性的細胞，而轉(zhuǎn)染了HLA-DR質(zhì)粒的L929細胞中僅有1％的細胞為熒光標(biāo)記陽性。

16、 7.直接免疫熒光法檢測人CD4和HLA-DR的表達 采用FITC標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體(RPA-T4)，通過直接免疫熒光法對人CD4蛋白在轉(zhuǎn)染后的L929細胞中的表達做測定，以轉(zhuǎn)染了pcDNA3-CD4質(zhì)粒但未加抗體的L929細胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒但加了抗體的L929細胞做對照。結(jié)果顯示對照組無熒光標(biāo)記檢出，而轉(zhuǎn)染了人CD4質(zhì)粒的L929細胞可見明顯綠色熒光。證實人CD4蛋白在細胞中得到表達。采用PE標(biāo)記的抗人HLA-D