木賊抗氧化損傷作用的有效部位提取及對(duì)人血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用.pdf

1、目的：前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)中藥木賊水煎劑和正丁醇提取物(脂溶部分和水溶部分)具有調(diào)節(jié)脂代謝，保護(hù)血管內(nèi)皮，改善動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)早期病變的作用，但對(duì)離體人血管內(nèi)皮是否有同樣的保護(hù)作用，尚未觀察，本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)木賊抗AS的有效部位進(jìn)行提取分離，旨在觀察木賊提取物對(duì)ox-LDL致人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用，從分子水平和基因表達(dá)調(diào)控水平深入探討木賊抗氧化損傷的藥理活性部位及作用機(jī)制。

2、 方法： 第一部分 1.木賊有效部位的提取稱(chēng)取一定質(zhì)量的中藥木賊，用體積為12倍木賊質(zhì)量的70％乙醇于圓底燒瓶中浸泡2小時(shí)后，電熱套小火加熱，回流提取三次，每次兩小時(shí)，將提取液濾紙過(guò)濾，并收集混勻，即得到木賊提取液。 2.木賊有效部位的分離木賊提取液減壓濃縮，使其中乙醇完全蒸發(fā)并使所剩液體的體積小于大孔樹(shù)脂的柱體積，將減壓濃縮得到的提取液加入處理好的大孔樹(shù)脂柱中，經(jīng)水洗脫，30％乙醇洗脫，70％乙醇洗脫，收集幾

3、次70％乙醇洗脫液得木賊的有效部位。 3.木賊中有效部位(即總黃酮和總酚酸)含量的計(jì)算分別取槲皮素(quercetin)對(duì)照品、阿魏酸(ferulic acid)對(duì)照品及70％乙醇洗脫液在紫外分光光度計(jì)上于200-400nm處掃描，確定波長(zhǎng)。分別制備槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算木賊中總黃酮和總酚酸含量。 4 木賊70％乙醇洗脫液中有效部位(總黃酮和總酚酸)純度的計(jì)算純度=用紫外分光光度計(jì)測(cè)得的有效部

4、位的量/提取物凈重×100％ 5木賊提取物培養(yǎng)液的制備將木賊70％乙醇洗脫液減壓濃縮。用二甲基亞砜(DMSO)溶解濃縮后的木賊洗脫液，然后用不含血清的低糖DMEM將其分別稀釋至1000μg/ml，500μg/ml，250μg/ml，并使DMSO的濃度為5％，56℃，30min滅活，-20℃保存。 第二部分 1.氧化低密度脂蛋白的制備采用化學(xué)沉淀法提取低密度脂蛋白(LDL)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其濃度，將LDL置于10

5、μmol/L CuSO4溶液中，37℃避光氧化24h，經(jīng)PH7.4 PBS透析24h，過(guò)濾除菌，得氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進(jìn)行LDL氧化產(chǎn)物共軛雙烯(OD)檢測(cè)。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其濃度。 2.細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別設(shè)正常對(duì)照組、氧化損傷組、木賊提取物高濃度(100μg/ml)組、木賊提取物中濃度(50μg/ml)組、木賊提取物低濃度(25μg/ml)組。觀察

6、各組內(nèi)皮細(xì)胞情況。 3指標(biāo)檢測(cè) 收集細(xì)胞和培養(yǎng)液后，倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。硝酸還原酶法和放射免疫分析法分別檢測(cè)培養(yǎng)液中NO和IL-8含量，化學(xué)比色法檢測(cè)細(xì)胞中NOS含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA，運(yùn)用半定量RT-PCR的方法，對(duì)iNOS、 IL-8及VCAM-1 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析。 結(jié)果： 第一部分 1.槲皮素、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)槲皮素

7、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=0.0150x-0.000774(r=0.989)，阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=0.009877x-0.0002864(r=0.995)，結(jié)果表明槲皮素在0.00212～0.00742mg/ml，阿魏酸在0.0016～0.0048mg/ml濃度范圍內(nèi)濃度與吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。 2.木賊中有效部位(總黃酮和總酚酸)含量木賊中以槲皮素計(jì)總黃酮含量為1.69 mg/g：以阿魏酸計(jì)總酚酸含量為1.23 mg/g：有效部位(總

8、黃酮和酚酸)含量2.92mg/g。 3.木賊70％乙醇洗脫液中有效部位(總黃酮和總酚酸)純度計(jì)算木賊70％乙醇洗脫液中有效部位的純度為63.28％，可用于干預(yù)細(xì)胞。 第二部分 1.正常血清，LDL，LDL氧化產(chǎn)物的電泳圖像化學(xué)沉淀法所得LDL的瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，與正常血清中LDL條帶處于同一水平。LDL氧化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，泳動(dòng)速率較LDL快近一倍。提示LDL的提取及氧化成功。

9、 2.LDL氧化曲線(xiàn)3個(gè)氧化時(shí)相即延遲期、快速反應(yīng)期、分解期明顯，氧化程度于10h左右已達(dá)到完全。 3.倒置相差顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)狀況正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞飽滿(mǎn)，無(wú)死亡細(xì)胞；氧化損傷組細(xì)胞生長(zhǎng)較差，細(xì)胞瘦小，萎縮，有部分細(xì)胞死亡；木賊提取物組細(xì)胞生長(zhǎng)較好，細(xì)胞較飽滿(mǎn)，少部分細(xì)胞變圓，一般情況好于氧化損傷組。以中濃度組生長(zhǎng)狀態(tài)最好。 4 內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡的觀察結(jié)果 4.1正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞鏡下可見(jiàn)細(xì)胞分布均勻，

10、形態(tài)完整，核區(qū)明顯，細(xì)胞核輪廓清楚，可見(jiàn)小、圓形、大量的分泌小泡位于細(xì)胞表面和細(xì)胞膜的邊緣。 4.2氧化損傷組內(nèi)皮細(xì)胞的改變鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜不清楚，胞膜皺襞明顯減少，胞質(zhì)稀疏，幾乎為裸核，核仁清晰，細(xì)胞連接輪廓可見(jiàn)，分泌小泡較少，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞受損嚴(yán)重，核區(qū)表面，核仁與胞質(zhì)交界處有數(shù)個(gè)大小不等、蠶蝕狀的破損，可見(jiàn)部分細(xì)胞固縮。 4.3木賊提取物組內(nèi)皮細(xì)胞的變化鏡下可見(jiàn)細(xì)胞體積較氧化損傷組增大，細(xì)胞形態(tài)完整，胞質(zhì)較氧化損

11、傷組豐滿(mǎn)、致密，細(xì)胞核完整，細(xì)胞核與胞質(zhì)間無(wú)破損，胞膜表面皺襞增多，分泌小泡較氧化損傷組增多。 5 培養(yǎng)液NO水平變化氧化損傷組NO濃度較正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，木賊提取物高，中，低濃度組NO濃度較氧化損傷組顯著升高(P＜0.01)。 6 細(xì)胞NOS活性變化氧化損傷組NOS較正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，iNOS較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，木賊提取物高，中，低濃度組NOS較氧化損傷組顯著升高(

12、P＜0.01)，iNOS表達(dá)量明顯低于氧化損傷組(P＜0.01)，用藥組間無(wú)明顯量效關(guān)系。 7 培養(yǎng)液IL-8水平變化氧化損傷組IL-8較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，木賊提取物高，中，低濃度組IL-8較氧化損傷組明顯降低(P＜0.01)。 8 細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)量變化氧化損傷組VCAM-1蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)。中劑量木賊提取物組VCAM-1蛋白表達(dá)較氧化損傷組顯著降低(P＜0.01)

13、。 9 細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的變化中濃度木賊提取物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用(P＜0.01)。 10 細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)的變化中濃度木賊提取物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用(P＜0.01)。 11細(xì)胞VCAM-1 mRNA表達(dá)的變化氧化損傷組的VCAM-1 mRNA表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，中濃度木賊提取物組mRNA表達(dá)量顯著低