

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、目的:前期動物實驗研究證實中藥木賊水煎劑和正丁醇提取物(脂溶部分和水溶部分)具有調(diào)節(jié)脂代謝,保護血管內(nèi)皮,改善動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)早期病變的作用,但對離體人血管內(nèi)皮是否有同樣的保護作用,尚未觀察,本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上,對木賊抗AS的有效部位進行提取分離,旨在觀察木賊提取物對ox-LDL致人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用,從分子水平和基因表達(dá)調(diào)控水平深入探討木賊抗氧化損傷的藥理活性部位及作用機制。
2、 方法: 第一部分 1.木賊有效部位的提取稱取一定質(zhì)量的中藥木賊,用體積為12倍木賊質(zhì)量的70%乙醇于圓底燒瓶中浸泡2小時后,電熱套小火加熱,回流提取三次,每次兩小時,將提取液濾紙過濾,并收集混勻,即得到木賊提取液。 2.木賊有效部位的分離木賊提取液減壓濃縮,使其中乙醇完全蒸發(fā)并使所剩液體的體積小于大孔樹脂的柱體積,將減壓濃縮得到的提取液加入處理好的大孔樹脂柱中,經(jīng)水洗脫,30%乙醇洗脫,70%乙醇洗脫,收集幾
3、次70%乙醇洗脫液得木賊的有效部位。 3.木賊中有效部位(即總黃酮和總酚酸)含量的計算分別取槲皮素(quercetin)對照品、阿魏酸(ferulic acid)對照品及70%乙醇洗脫液在紫外分光光度計上于200-400nm處掃描,確定波長。分別制備槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算木賊中總黃酮和總酚酸含量。 4 木賊70%乙醇洗脫液中有效部位(總黃酮和總酚酸)純度的計算純度=用紫外分光光度計測得的有效部
4、位的量/提取物凈重×100% 5木賊提取物培養(yǎng)液的制備將木賊70%乙醇洗脫液減壓濃縮。用二甲基亞砜(DMSO)溶解濃縮后的木賊洗脫液,然后用不含血清的低糖DMEM將其分別稀釋至1000μg/ml,500μg/ml,250μg/ml,并使DMSO的濃度為5%,56℃,30min滅活,-20℃保存。 第二部分 1.氧化低密度脂蛋白的制備采用化學(xué)沉淀法提取低密度脂蛋白(LDL),考馬斯亮藍(lán)法測定其濃度,將LDL置于10
5、μmol/L CuSO4溶液中,37℃避光氧化24h,經(jīng)PH7.4 PBS透析24h,過濾除菌,得氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL),4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并進行LDL氧化產(chǎn)物共軛雙烯(OD)檢測。考馬斯亮藍(lán)法測定其濃度。 2.細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,分別設(shè)正常對照組、氧化損傷組、木賊提取物高濃度(100μg/ml)組、木賊提取物中濃度(50μg/ml)組、木賊提取物低濃度(25μg/ml)組。觀察
6、各組內(nèi)皮細(xì)胞情況。 3指標(biāo)檢測 收集細(xì)胞和培養(yǎng)液后,倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。硝酸還原酶法和放射免疫分析法分別檢測培養(yǎng)液中NO和IL-8含量,化學(xué)比色法檢測細(xì)胞中NOS含量,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA,運用半定量RT-PCR的方法,對iNOS、 IL-8及VCAM-1 mRNA的表達(dá)情況進行分析。 結(jié)果: 第一部分 1.槲皮素、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線槲皮素
7、標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0150x-0.000774(r=0.989),阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.009877x-0.0002864(r=0.995),結(jié)果表明槲皮素在0.00212~0.00742mg/ml,阿魏酸在0.0016~0.0048mg/ml濃度范圍內(nèi)濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。 2.木賊中有效部位(總黃酮和總酚酸)含量木賊中以槲皮素計總黃酮含量為1.69 mg/g:以阿魏酸計總酚酸含量為1.23 mg/g:有效部位(總
8、黃酮和酚酸)含量2.92mg/g。 3.木賊70%乙醇洗脫液中有效部位(總黃酮和總酚酸)純度計算木賊70%乙醇洗脫液中有效部位的純度為63.28%,可用于干預(yù)細(xì)胞。 第二部分 1.正常血清,LDL,LDL氧化產(chǎn)物的電泳圖像化學(xué)沉淀法所得LDL的瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶,與正常血清中LDL條帶處于同一水平。LDL氧化產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶,泳動速率較LDL快近一倍。提示LDL的提取及氧化成功。
9、 2.LDL氧化曲線3個氧化時相即延遲期、快速反應(yīng)期、分解期明顯,氧化程度于10h左右已達(dá)到完全。 3.倒置相差顯微鏡下細(xì)胞生長狀況正常對照組細(xì)胞生長良好,細(xì)胞飽滿,無死亡細(xì)胞;氧化損傷組細(xì)胞生長較差,細(xì)胞瘦小,萎縮,有部分細(xì)胞死亡;木賊提取物組細(xì)胞生長較好,細(xì)胞較飽滿,少部分細(xì)胞變圓,一般情況好于氧化損傷組。以中濃度組生長狀態(tài)最好。 4 內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡的觀察結(jié)果 4.1正常對照組內(nèi)皮細(xì)胞鏡下可見細(xì)胞分布均勻,
10、形態(tài)完整,核區(qū)明顯,細(xì)胞核輪廓清楚,可見小、圓形、大量的分泌小泡位于細(xì)胞表面和細(xì)胞膜的邊緣。 4.2氧化損傷組內(nèi)皮細(xì)胞的改變鏡下可見細(xì)胞膜不清楚,胞膜皺襞明顯減少,胞質(zhì)稀疏,幾乎為裸核,核仁清晰,細(xì)胞連接輪廓可見,分泌小泡較少,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞受損嚴(yán)重,核區(qū)表面,核仁與胞質(zhì)交界處有數(shù)個大小不等、蠶蝕狀的破損,可見部分細(xì)胞固縮。 4.3木賊提取物組內(nèi)皮細(xì)胞的變化鏡下可見細(xì)胞體積較氧化損傷組增大,細(xì)胞形態(tài)完整,胞質(zhì)較氧化損
11、傷組豐滿、致密,細(xì)胞核完整,細(xì)胞核與胞質(zhì)間無破損,胞膜表面皺襞增多,分泌小泡較氧化損傷組增多。 5 培養(yǎng)液NO水平變化氧化損傷組NO濃度較正常對照組明顯降低(P<0.01),木賊提取物高,中,低濃度組NO濃度較氧化損傷組顯著升高(P<0.01)。 6 細(xì)胞NOS活性變化氧化損傷組NOS較正常對照組明顯降低(P<0.01),iNOS較正常對照組明顯升高(P<0.01),木賊提取物高,中,低濃度組NOS較氧化損傷組顯著升高(
12、P<0.01),iNOS表達(dá)量明顯低于氧化損傷組(P<0.01),用藥組間無明顯量效關(guān)系。 7 培養(yǎng)液IL-8水平變化氧化損傷組IL-8較正常對照組明顯升高(P<0.01),木賊提取物高,中,低濃度組IL-8較氧化損傷組明顯降低(P<0.01)。 8 細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)量變化氧化損傷組VCAM-1蛋白表達(dá)較正常對照組顯著升高(P<0.01)。中劑量木賊提取物組VCAM-1蛋白表達(dá)較氧化損傷組顯著降低(P<0.01)
13、。 9 細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的變化中濃度木賊提取物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用(P<0.01)。 10 細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)的變化中濃度木賊提取物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-8 mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用(P<0.01)。 11細(xì)胞VCAM-1 mRNA表達(dá)的變化氧化損傷組的VCAM-1 mRNA表達(dá)量顯著高于正常對照組(P<0.01),中濃度木賊提取物組mRNA表達(dá)量顯著低
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 探討抗氧化劑對人血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用.pdf
- 木賊抗氧化損傷作用的有效部位提取及對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用.pdf
- 四物湯對血虛大鼠血管內(nèi)皮損傷的干預(yù)作用.pdf
- 生姜有效部位對高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮的保護作用.pdf
- 藥用栽培牡丹分子標(biāo)記及其有效成分對血管內(nèi)皮炎癥損傷的保護作用研究.pdf
- 機械牽張對肺血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)、通透性的影響及作用機制研究.pdf
- 辛伐他汀對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)損傷的保護作用.pdf
- 降脂通絡(luò)軟膠囊對高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮的干預(yù)作用.pdf
- 鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用-碩士論文
- PPAR β-δ對熱預(yù)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf
- 脂毒性對胰島微血管內(nèi)皮和胰島功能的損傷及GLP-1的干預(yù)作用.pdf
- 人血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用研究.pdf
- 辛伐他汀對炎癥損傷后血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的干預(yù)研究.pdf
- 內(nèi)皮祖細(xì)胞移植修復(fù)肺血管內(nèi)皮炎癥損傷的實驗研究.pdf
- 砷對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及硒干預(yù)作用的研究.pdf
- 異黃酮對鎘致血管內(nèi)皮細(xì)胞不良效應(yīng)的干預(yù)作用.pdf
- 尿酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及其對細(xì)胞的損傷作用.pdf
- 餐后血脂對血管內(nèi)皮的損傷作用.pdf
- PKCδ抑制劑對脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的干預(yù)作用.pdf
- 白刺黃酮的提取分離及有效部位抗氧化作用的研究.pdf
評論
0/150
提交評論