北柴胡皂苷合成相關(guān)P450、UGT基因的篩選、克隆及遺傳轉(zhuǎn)化初步研究.pdf

1、北柴胡Bupleurum chinense DC.是中藥柴胡的重要基源植物，柴胡皂苷是其主要藥效成分。細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450; P450)和糖基轉(zhuǎn)移酶(uridinediphosphate(UDP) glycosyltransferase; UGT）是柴胡皂苷生物合成途徑的后修飾酶，其后修飾作用是形成柴胡皂苷結(jié)構(gòu)多樣性的主要因素。課題組前期通過北柴胡轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到了246個(gè)P450獨(dú)立基因和102個(gè)GT獨(dú)立

2、基因(其中49個(gè)UGT)。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)其中14個(gè)P450基因和20個(gè)UGT基因進(jìn)行了篩選，得到可能參與柴胡皂苷生物合成的2個(gè)P450基因和3個(gè)UGT基因;對(duì)其中一個(gè)P450基因和兩個(gè)UGT基因進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆和載體構(gòu)建，并建立了北柴胡花藥愈傷組織高效再生體系，進(jìn)行了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的北柴胡遺傳轉(zhuǎn)化初步研究，為下一步功能驗(yàn)證并最終闡明柴胡皂苷生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　 1.從北柴胡454測(cè)序并注釋得到的獨(dú)立

3、基因中選取14個(gè)P450基因和20個(gè)UGT基因，通過熒光定量分析它們的茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)表達(dá)特性和組織表達(dá)特性，最終篩選出與β-香樹脂合酶（EC5.4.9.9.，β-amyrin synthase，β-AS）基因共表達(dá)的2個(gè)P450基因(P450-7和P450-12)和3個(gè)UGT基因（UGT-3、UGT-5和UGT-15），初步確定這2個(gè)P450基因和3個(gè)UGT基因可能參與北柴胡中柴胡皂苷生物合成。
　　 2.利用LD-

4、PCR方法克隆了可能參與柴胡皂苷生物合成的細(xì)胞色素P450基因P450-7全長(zhǎng)cDNA，命名為BcCYP87E，其開放閱讀框(ORF)1473 bp，編碼490個(gè)氨基酸。根據(jù)其ORF序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的PCR引物，擴(kuò)增、酶切后插入到雙元載體pCAMBIA-SUPER1300中，構(gòu)建了這一基因的過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體。
　　 3.通過RACE和LD-PCR方法擴(kuò)增可能參與柴胡皂苷生物合成的UGT基因UGT-3全長(zhǎng)cDNA，命名為B

5、cUGT10，其ORF長(zhǎng)1365 bp，編碼454個(gè)氨基酸。設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的PCR引物，PCR擴(kuò)增BcUGT10的ORF和部分片段后，酶切，分別插入到pCAMBIA-SUPER1300和pHANNIBAL中。重組的pHANNIBAL經(jīng)NotⅠ酶切后插入到pART27中。最終構(gòu)建出過表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體。
　　 4.通過RACE和LD-PCR方法擴(kuò)增可能參與柴胡皂苷生物合成的UGT基因UGT-15，命名為BcUGT8，該基

6、因ORF長(zhǎng)1335 bp，編碼444個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)了該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位和三維結(jié)構(gòu)。同時(shí)設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的PCR引物，PCR擴(kuò)增其ORF，酶切后，插入到pET-28a(+)載體中，構(gòu)建出原核表達(dá)載體。
　　 5.以花粉發(fā)育處于單核期的北柴胡花藥為外殖體誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，置于20種含不同植物激素的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化。結(jié)果在MS+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠5g/L培養(yǎng)基上分化率

7、最高，為60％;其次為MS+ ZT1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠5 g/L，為58％。再生芽在生根培養(yǎng)基MS+蔗糖30 g/L+植物凝膠5 g/L和1/2 MS+ NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+植物凝膠5g/L中均可生根，生根率均為100％。由此建立了北柴胡花藥愈傷組織高效穩(wěn)定的再生體系。
　　 6.以北柴胡不同愈傷組織或葉柄為受體，進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BcCYP87E植物過量表達(dá)載體p1300-BcC