新型鈉通道調(diào)制劑BmKαⅣ的基因克隆、表達及功能研究.pdf

1、本論文工作主要利用基因工程方法克隆和表達了一個新型肽類鈉通道調(diào)制劑BmKαⅣ，采用電生理學、藥理學、毒理學、病理學和行為學方法系統(tǒng)研究了BmKαⅣ與鈉通道相互作用的分子結構與功能基礎以及其可能的生物進化地位，同時探討了其誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的分子和細胞機制。
　　 1.新型肽類鈉通道調(diào)制劑BmKαⅣ的克隆、表達及藥理功能鑒定
　　 本研究從東亞鉗蝎毒腺基因組中首次克隆到一新型長鏈蝎神經(jīng)毒素基因，命名為BmKαⅣ，并成功地實現(xiàn)

2、了其在大腸桿菌中的功能性表達。BmKαⅣ基因全長898bp，由兩個外顯子和插于二者中間的一503bp內(nèi)含子組成，編碼66個氨基酸殘基的成熟多肽。毒理學結果顯示，BmKαⅣ對哺乳動物和昆蟲均有一定毒性作用。藥理結合結果顯示，BmKαⅣ既可與大鼠大腦皮層突觸體膜結合，亦可與蟑螂腹神經(jīng)索神經(jīng)膜結合。BmKαⅣ與這兩種膜的結合可以被經(jīng)典α毒素AaHⅡ、類β毒素BmKAS、抑制型昆蟲毒素BmKIT2以及過渡型毒素BmKabT所抑制，但不能被類α毒

3、素BmKⅠ所抑制。電壓鉗結果顯示，BmKαⅣ可顯著增加表達于爪蟾卵母細胞的rNav1.2峰鈉電流，并延長rNav1.2鈉電流失活化相。序列比對和模建分析結果顯示，BmKαⅣ具區(qū)別于已知的經(jīng)典α毒素、α昆蟲毒素和類α毒素的分子結構基礎。上述結果表明：BmKαⅣ為隸屬于α蝎神經(jīng)毒素的一個新亞族，結構和功能特征表現(xiàn)為介于經(jīng)典α、類α和α昆蟲蝎神經(jīng)毒素之間的一個新型過渡性嵌合體。因此，BmKαⅣ可作為特異性分子工具，用于電壓門控鈉通道的功能與分

4、子結構解析，并對研究蝎神經(jīng)毒素結構與功能進化有重要價值。
　　 2.BmKαⅣ誘發(fā)大鼠驚厥發(fā)作及其細胞機制
　　 大鼠一側腦室注射BmKαⅣ(0.5-3μg)可劑量依賴性地誘發(fā)大鼠驚厥行為發(fā)作和大腦皮層癲癇樣放電。體外電生理記錄研究顯示，BmKαⅣ可顯著增強表達rNav1.2的爪蟾卵母細胞自發(fā)放效應，增加rNav1.2的persistent和resurgent電流幅值。顯微熒光離子成像結果顯示，BmKαⅣ可顯著增加大鼠腦

5、突觸體膜內(nèi)鈣離子和鈉離子濃度，并且這種效應可以完全被TTX所抑制。以大鼠皮層突觸體為神經(jīng)末梢標本，通過酶聯(lián)熒光法檢測結果表明，BmKαⅣ可誘發(fā)大鼠皮層突觸體的谷氨酸釋放，此效應亦能被TTX所阻斷。上述實驗結果表明：BmKαⅣ可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作；BmKαⅣ能顯著性易化鈉通道(特別是rNav1.2)介導的興奮性；BmKαⅣ增加大腦皮層突觸體內(nèi)鈣離子和鈉離子濃度；BmKαⅣ誘發(fā)大腦皮層突觸體谷氨酸釋放；BmKαⅣ誘發(fā)癲癇發(fā)作的可能機制為BmK