人肺泡上皮對(duì)急性肺損傷肺泡內(nèi)凝血和纖溶調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、第一部分人肺泡上皮對(duì)肺泡內(nèi)凝血的調(diào)節(jié)作用 目的：蛋白C通路(PCpathway)是體內(nèi)調(diào)節(jié)凝血的主要途徑。有研究顯示，急性肺損傷(ALI)時(shí)肺泡內(nèi)凝血活動(dòng)增強(qiáng)，且伴有肺泡內(nèi)的蛋白C通路的顯著變化。本課題旨在研究人肺泡上皮細(xì)胞能否表達(dá)和釋放活化蛋白C所需的兩個(gè)受體一凝血酶調(diào)節(jié)素(TM)和內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)。并初步探討其釋放的機(jī)制。方法：1)采集急性肺損傷(ALI)和靜水壓性肺水腫(hdrostaticpulmonary

2、edema)患者的肺泡水腫液和血漿，采用ELISA方法測(cè)定其中EPCR的含量，并與其中TM含量作相關(guān)性分析。2)體外培養(yǎng)人肺泡上皮樣A549細(xì)胞株和原代分離的人肺泡II型上皮細(xì)胞并給予不同的病理刺激后測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞裂解液中EPCR和TM蛋白含量的變化以及由此引起的肺泡細(xì)胞表面活化蛋白C(APC)生成的變化。3)測(cè)定肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)佛波醇(PMA)及金屬蛋白酶抑制劑等處理后釋放EPCR和TM量的變化，探討可能的釋放機(jī)制。4)用real

3、-timePCR檢測(cè)EPCR和TM在肺泡上皮細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果：1)ALI患者的肺泡水腫液和血漿中的EPCR含量均高于靜水壓性肺水腫液，ALI肺泡水腫液中的EPCR含量顯著高于血漿中的含量，且其含量高低與疾病的嚴(yán)重程度成正比，結(jié)合以往的研究結(jié)果，ALI患者肺泡水腫液中的EPCR含量與TM含量成正相關(guān)，提示肺泡上皮可能為肺泡內(nèi)TM和EPCR的肺內(nèi)來源。2)肺泡上皮細(xì)胞能表達(dá)活性TM和EPCR,并能在其表面活化蛋白C。炎癥因子混合物cytom

4、ix(TNF-ot，IL-1β，IFN-7)刺激促進(jìn)上皮細(xì)胞釋放EPCR和TM增多，并呈時(shí)間和劑量依賴模式，而細(xì)胞表面活化蛋白C的活力隨EPCR和TM的釋放而下降。3)金屬蛋白酶抑制劑TAPI-0和GM6001可以抑制上皮細(xì)胞釋放EPCR和TM，并部分恢復(fù)蛋白C的活化功能，提示EPCR和TM的釋放是金屬蛋白酶水解介導(dǎo)的。4)LPS和cytomix刺激導(dǎo)致EPCR和TM釋放的速度不同，LPS引起的釋放速度較快，可以被TIMP-3抑制，而不

5、能被TIMP．1,2抑制，提示腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶(TACE／ADAM．17)介導(dǎo)了快速釋放過程，而Cytomix引起的釋放速度較慢，均不能被TIMP．1、2、3抑制，提示不同金屬蛋白酶參與其中。5)肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)TM和EPCRmRNA，但cytomix刺激不改變基因表達(dá)水平。結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)首次采用原代人肺泡上皮細(xì)胞證實(shí)了蛋白C通路在人肺泡上皮存在。肺泡上皮細(xì)胞在受到外界病理刺激后能通過釋放EPCR和TM從而改變肺泡上皮表面APC

6、的含量，而影響肺泡內(nèi)肺泡內(nèi)凝血和炎癥過程。初步研究發(fā)現(xiàn)EPCR和TM的釋放與細(xì)胞內(nèi)的金屬蛋白酶水解過程有關(guān)，LPS介導(dǎo)的EPCR和TM釋放是由TACE／ADAM一17介導(dǎo)的，而cytomix引起的EPCR和TM釋放可能是由其他基質(zhì)蛋白酶介導(dǎo)的。我們發(fā)現(xiàn)的肺泡上皮細(xì)胞能調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)凝血的功能將為ALI的發(fā)病和治療提供新的思路和策略。 第二部分人肺上皮細(xì)胞通過纖溶酶原激活抑制物(PAI-1)調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)的纖溶狀態(tài) 目的：目前認(rèn)為

7、ALI時(shí)肺泡內(nèi)纖溶活性降低主要是由于肺泡內(nèi)增高的PAl．1所致，PAI．1是體內(nèi)主要的纖溶抑制物，本研究旨在探討人肺泡上皮是否能表達(dá)并釋放PAI．1并通過其調(diào)節(jié)肺泡內(nèi)纖溶狀態(tài)。方法：1)體外培養(yǎng)A549和人肺泡II型上皮細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面PAI活性測(cè)定來測(cè)定肺泡上皮細(xì)胞的纖溶活性。2)用ELISA法測(cè)定cytomix刺激A549及人肺泡II型上皮細(xì)胞后肺泡培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中的PAI．1蛋白含量的變化。3)采用NorthernBlot法

8、測(cè)定肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)PAl．1mRNA的表達(dá)。結(jié)果：1)炎癥因子刺激使肺泡上皮細(xì)胞表面的纖溶活性顯著降低，同時(shí)伴隨著PAI．1釋放增加，細(xì)胞裂解液中的PAI—l蛋白含量亦增加。2)炎癥因子刺激可上調(diào)PAI．1mRNA在肺泡上皮中的表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次采用原代人肺泡II型上皮細(xì)胞證實(shí)其和A549細(xì)胞一樣能表達(dá)和釋放PAI．1，炎癥刺激能上調(diào)肺泡細(xì)胞PAI一1的表達(dá)，引起PAI．1釋放增多，從而降低肺泡表面的纖溶活性，顯示肺泡上皮細(xì)胞能通過