肺泡上皮間緊密及縫隙連接在急性肺損傷中結(jié)構(gòu)及功能的改變.pdf

1、研究背景： 急性肺損傷(Acutelunginjury,ALI)是以間質(zhì)性水腫和肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷為主要表現(xiàn)的急性呼吸衰竭，后期則發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(Acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)。其特點(diǎn)是發(fā)病急、病情兇險(xiǎn)、死亡率高(達(dá)50％)，發(fā)病機(jī)理至今尚未完全闡明，臨床上沒(méi)有特效的治療方法。因此探討ALI發(fā)病機(jī)制和救治方法是當(dāng)前臨床亟待解決的難題之一。肺泡上皮細(xì)胞(alveolarepith

2、elialcell，AEC)之間的連接包括緊密連接(Tightjunction，TJ)和縫隙連接(Gapjunction，GJ)。這兩種細(xì)胞的連接方式保證了肺泡組織血?dú)馄琳系耐暾?，發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞兩側(cè)及細(xì)胞內(nèi)外液體、離子、代謝產(chǎn)物的分布、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞。TJ有兩個(gè)基本的功能，即屏障功能(barrierfunction，BF)和柵欄功能(fencefunction，F(xiàn)F)。TJ的屏障功能可以調(diào)節(jié)水，離子，不同大小的分子甚至是癌細(xì)

3、胞通過(guò)細(xì)胞之間的間隙，其BF與水腫、黃疸、腹瀉及腫瘤的轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程相關(guān)。而TJ的柵欄功能則與細(xì)胞的極性有關(guān)，換言之，TJ就像柵欄一樣阻止細(xì)胞膜頂膜上的分子與側(cè)膜上的分子相互混合，這種功能與腫瘤生物學(xué)即細(xì)胞極性的喪失有密切的聯(lián)系。GJ形成的細(xì)胞間通道為縫隙連接通道(gapjunctionchannel)，能通過(guò)大小約1000Da的物質(zhì)，可使親水性的離子、分子、代謝產(chǎn)物或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子直接彌散，從而發(fā)揮門控作用，調(diào)節(jié)離子、電流、低分子代謝產(chǎn)

4、物在細(xì)胞之間的相互轉(zhuǎn)運(yùn)及分布。 方法： 1.動(dòng)物模型的復(fù)制：采用OA(按0.25mi/Kg體重的劑量)經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢注入復(fù)制ALI模型，分別于注射OA后1、5、12、24和48小時(shí)剪斷腹主動(dòng)脈放血處死，取出肺臟。將取出的一部分肺組織經(jīng)電鏡液固定等處理后分別用掃描電鏡和透射電鏡觀察肺泡超微結(jié)構(gòu)的變化；取出的另一部分肺組織制成蠟塊經(jīng)切片后用HE染色法觀察肺組織結(jié)構(gòu)的變化。 2.石蠟切片應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immuno

5、histochemistry,IH)SP法檢測(cè)Cx26、Claudin-3在正常肺組織及急性肺損傷組織中的表達(dá)，光鏡下觀察，數(shù)出每個(gè)隨機(jī)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率。 3.石蠟切片應(yīng)用原位雜交(insituhybridization，ISH)方法檢測(cè)Cx32mRNA在正常肺組織及急性肺損傷組織中的表達(dá)，光鏡下觀察，數(shù)出每個(gè)隨機(jī)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率。 4.

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組均數(shù)的比較進(jìn)行單因素方差分析，如有顯著性差異，需進(jìn)一步作多重比較。若方差齊性則采用LSD法作兩兩間的比較；若方差不齊則采用Tamhane'sT2法作兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。 結(jié)果： 1.損傷組在注射OA后都出現(xiàn)不同程度的呼吸加快、窘迫、紫紺及泡沫血痰等表現(xiàn)。正常對(duì)照組不出現(xiàn)上述表現(xiàn)。取出的損傷肺體積明顯增大，呈廣泛的充血、水腫及出血樣改變，肺邊緣變鈍，以雙側(cè)中、下肺葉

7、病變較重，氣管內(nèi)有粉紅色泡沫樣痰；HE染色切片光鏡下可見(jiàn)肺泡壁明顯增寬，肺間質(zhì)充血、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)和肺泡水腫，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)淡紅染水腫液和大量中性粒細(xì)胞滲出。正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化。 2.電鏡下肺組織超微結(jié)構(gòu)的改變：透射電鏡下急性肺損傷大鼠可見(jiàn)肺間質(zhì)細(xì)胞大量破壞，無(wú)法辨認(rèn)細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，見(jiàn)不到完整的細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞膜斷裂，細(xì)胞核溶解；而正常大鼠肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肺泡上皮細(xì)胞之間存在完整

8、的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)。掃描電鏡下可見(jiàn)正常大鼠肺泡壁光滑，肺泡內(nèi)無(wú)滲出物質(zhì)；而急性肺損傷大鼠的肺泡腔內(nèi)充滿顆粒和絮狀物質(zhì)，這些物質(zhì)與肺泡上皮細(xì)胞或肺間質(zhì)相連并在肺泡腔內(nèi)纏繞形成球形顆?；蛳嗷ミB結(jié)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 3.Cx26的表達(dá)及其表達(dá)的變化：免疫組化顯示Cx26陽(yáng)性染色主要定位于胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中。Cx26在正常組及損傷后1、5、12、24、48小時(shí)組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(12.25±1.12)％、(9.11±0.62)％、(5.71±0

9、.52)％、(6.22±0.77)％、(6.64±0.53)％、(8.25±0.53)％。各組Cx26陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分率方差齊性(P=0.393)，方差分析有顯著性差異(F=115.638,P＜0.001)，進(jìn)一步用LSD法做各組間的多重比較。LSD檢驗(yàn)結(jié)果：正常對(duì)照組與損傷各組的陽(yáng)性細(xì)胞率有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后5小時(shí)與損傷后12小時(shí)組、損傷后12小時(shí)與損傷后24小時(shí)組間無(wú)顯著性差異(P值分別為0.115、0.193)

10、；其它各組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。損傷5小時(shí)后Cx26的陽(yáng)性表達(dá)率有上升趨勢(shì)。 4.CX32mRNA表達(dá)及其變化：原位雜交顯示Cx32mRNA的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。Cx32mRNA在正常組及損傷后1、5、12、24、48小時(shí)組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(13.95±1.57)％、(5.53±0.98)％、(4.83±1.00)％、(5.27±0.93)％、(6.80±0.87)％、(8.92±0.73)％。各組Cx32

11、mRNA陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分率方差齊性(P=0.201)，方差分析有顯著性差異(F=109.804,P＜0.001)，進(jìn)一步用LSD法做各組間的多重比較。LSD檢驗(yàn)結(jié)果：正常組與損傷各組比較有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后48小時(shí)組與其余各組比較有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后1小時(shí)組與5小時(shí)組、1小時(shí)組與12小時(shí)組、5小時(shí)組與12小時(shí)組間比較無(wú)顯著性差異(P值分別為0.140、0.585、0.348)；其余各組間的比較有顯著

12、性差異(P＜0.05)。損傷5小時(shí)后Cx32mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率有上升趨勢(shì)。 5、claudin-3表達(dá)及其變化：免疫組化結(jié)果顯示claudin-3陽(yáng)性染色主要定位于胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中。claudin-3在正常組及損傷后1、5、12、24、48小時(shí)組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為(18.45±2.37)％、(12.08±1.10)％、(9.19±1.08)％、(7.75±1.70)％、(11.81±2.07)％、(13.54±1.21)％。各

13、組claudin-3陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分率方差齊性(P=0.127)，方差分析有顯著性差異(F=50.523,P＜0.001)，進(jìn)一步用LSD法做各組間的多重比較。LSD檢驗(yàn)結(jié)果：正常組與損傷各組比較有顯著性差異(P＜0.001)；損傷后1小時(shí)組與24小時(shí)組、1小時(shí)組與48小時(shí)組、5小時(shí)組與12小時(shí)組間比較無(wú)顯著性差異(P值分別為0.714、0.055、0.058)；其余各組間的比較有顯著性差異(P＜0.05)。損傷12小時(shí)后claudi