間充質干細胞高分子量分泌成分對輻射性腸損傷的修復作用.pdf

1、輻射損傷常發(fā)生在核爆炸、核泄漏、核恐怖及臨床腫瘤病人的放療過程中。體內代謝更新快的組織對射線最為敏感,如造血組織、腸道組織。腹部腫瘤病人接受一定劑量的照射,腸隱窩內的干細胞及腸絨毛結構都會遭到一定程度的破壞,進而導致腸粘膜結構破壞,腸道的物理屏障和免疫屏障功能不再完整,腸腔內的大量致病生物及毒性物質進入血液和體液循環(huán),引起全身病變,嚴重者引起全身多器官的感染、衰竭。最后導致死亡。目前,針對放射性腸損傷的治療仍以對癥治療為主,多種細胞因子

2、聯(lián)合應用雖然取得了一定的效果,但不是太理想,應用細胞因子的種類和組合方式也有待進一步探索優(yōu)化。因此,探索促放射性腸損傷修復的有效方法具有重要的研究意義。
　　間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)最早是從骨髓中分離獲得的一類獨立于造血干細胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)的成體干細胞,具有很強的自我更新和多向分化潛能,在相應的誘導環(huán)境下可以分化為中胚層來源的成骨、軟骨

3、、脂肪細胞,甚至分化為其他胚層的組織細胞。又由于MSCs的低免疫原性,MSCs被認為是最為理想的組織工程修復細胞。大量的臨床實驗也證明了MSCs在細胞治療方面的優(yōu)越性及可行性。
　　移植到體內的 MSCs通過什么機制發(fā)揮治療作用,一直有幾種不同的觀點,(1)歸巢到損傷的組織,并分化為該種組織細胞,起到組織修復的作用,(2)歸巢到損傷組織,與相應的細胞融合,(3)進入體內的MSCs通過旁/內分泌的方式分泌大量的生長因子、趨化因子發(fā)揮

4、治療作用。已實驗證實,MSCs在培養(yǎng)過程中產生大量的細胞因子分泌到胞外。據此設計了本課題:建立一個輻射性腸損傷模型,分離培養(yǎng)鑒定臍帶源MSCs,收集處理MSCs低氧條件培養(yǎng)液,觀察其對輻射性腸損傷的修復作用。
　　一、小鼠輻射性腸損傷模型的建立：
　　將 Balb/C小鼠麻醉固定于塑料盒內,首尾及四肢用鉛磚屏蔽,分為五組,每組10只,分別給予60Coγ射線7.0Gy、8.5Gy、10.0yG、11.5Gy、13.0Gy五個劑

5、量腹部局部照射。觀察輻照后30天內各組小鼠的存活率,根據存活率、小腸病理切片及輻照后小鼠的活動表現(xiàn),選擇10Gy作為后續(xù)實驗的照射劑量。
　　二、臍帶(umbilical cord, UC)源間充質干細胞的分離、純化、誘導鑒定：
　　無菌收集剛出生胎兒臍帶組織,去除動靜脈,剩余臍帶結締組織成分,從源頭上純化細胞。將臍帶剪碎成2cm3左右大小的小塊,植入培養(yǎng)皿內,五天左右可見組織塊邊緣有少量貼壁的細胞爬出。換液,去除懸浮細胞,

6、10天左右吸去組織塊,待細胞長至80％融合,消化傳代。傳代過程中細胞得到進一步純化,細胞呈典型的長梭型,貼壁生長,我們取3-5代的細胞誘導成骨、成脂分化。成骨誘導14天茜素紅染色,鏡下可見染成紅色的明顯的鈣節(jié)節(jié)。成脂誘導第8天油紅O染色,鏡下可見被染成橘紅色的脂滴。根據細胞形態(tài)特征及誘導分化能力,證明我們分離的細胞即為MSCs。
　　三、MSCs低氧條件培養(yǎng)液的制備：
　　選3-5代MSCs接種到培養(yǎng)瓶中,低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小

7、時,收集培養(yǎng)上清,Elisa測低氧與非低氧對照組細胞因子含量。3KD超濾管超濾濃縮,得MSCs分泌因子大分子組分。用于后續(xù)體內外實驗。
　　四、MSCs及其低氧分泌大分子成分對輻照致腸損傷小鼠的保護作用：
　　40只Balb/C小鼠按平均體重每組10只分為照射對照、MSCs、單次MSCs分泌大分子、多次MSCs分泌大分子四組。40只小鼠進行腹部局部10Gy60Coγ射線照射,照射結束1h內各組分別給予相應治療。觀察急性期內小

8、鼠腹瀉率,記錄30天內小鼠的存活情況、體重變化、測小鼠外周血象。結果顯示連續(xù)多次給予 MSCs分泌大分子成分能明顯減少小鼠腹瀉,對小鼠體重及外周血也有一定的改善作用,30天內小鼠未出現(xiàn)死亡情況。
　　五、小腸病理學改變：
　　實驗分照射對照組、MSCs組、多次MSCs分泌大分子組,每組40只小鼠,各組小鼠接受8.5Gy60Coγ射線腹部局部照射,照后1、3、7、11、21、30、60天各時間點各組活殺5只小鼠取空腸,福爾馬林