間充質(zhì)干細(xì)胞高分子量分泌成分對(duì)輻射性腸損傷的修復(fù)作用.pdf

1、輻射損傷常發(fā)生在核爆炸、核泄漏、核恐怖及臨床腫瘤病人的放療過程中。體內(nèi)代謝更新快的組織對(duì)射線最為敏感,如造血組織、腸道組織。腹部腫瘤病人接受一定劑量的照射,腸隱窩內(nèi)的干細(xì)胞及腸絨毛結(jié)構(gòu)都會(huì)遭到一定程度的破壞,進(jìn)而導(dǎo)致腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞,腸道的物理屏障和免疫屏障功能不再完整,腸腔內(nèi)的大量致病生物及毒性物質(zhì)進(jìn)入血液和體液循環(huán),引起全身病變,嚴(yán)重者引起全身多器官的感染、衰竭。最后導(dǎo)致死亡。目前,針對(duì)放射性腸損傷的治療仍以對(duì)癥治療為主,多種細(xì)胞因子

2、聯(lián)合應(yīng)用雖然取得了一定的效果,但不是太理想,應(yīng)用細(xì)胞因子的種類和組合方式也有待進(jìn)一步探索優(yōu)化。因此,探索促放射性腸損傷修復(fù)的有效方法具有重要的研究意義。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)最早是從骨髓中分離獲得的一類獨(dú)立于造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)的成體干細(xì)胞,具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能,在相應(yīng)的誘導(dǎo)環(huán)境下可以分化為中胚層來源的成骨、軟骨

3、、脂肪細(xì)胞,甚至分化為其他胚層的組織細(xì)胞。又由于MSCs的低免疫原性,MSCs被認(rèn)為是最為理想的組織工程修復(fù)細(xì)胞。大量的臨床實(shí)驗(yàn)也證明了MSCs在細(xì)胞治療方面的優(yōu)越性及可行性。
　　移植到體內(nèi)的 MSCs通過什么機(jī)制發(fā)揮治療作用,一直有幾種不同的觀點(diǎn),(1)歸巢到損傷的組織,并分化為該種組織細(xì)胞,起到組織修復(fù)的作用,(2)歸巢到損傷組織,與相應(yīng)的細(xì)胞融合,(3)進(jìn)入體內(nèi)的MSCs通過旁/內(nèi)分泌的方式分泌大量的生長因子、趨化因子發(fā)揮

4、治療作用。已實(shí)驗(yàn)證實(shí),MSCs在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子分泌到胞外。據(jù)此設(shè)計(jì)了本課題:建立一個(gè)輻射性腸損傷模型,分離培養(yǎng)鑒定臍帶源MSCs,收集處理MSCs低氧條件培養(yǎng)液,觀察其對(duì)輻射性腸損傷的修復(fù)作用。
　　一、小鼠輻射性腸損傷模型的建立：
　　將 Balb/C小鼠麻醉固定于塑料盒內(nèi),首尾及四肢用鉛磚屏蔽,分為五組,每組10只,分別給予60Coγ射線7.0Gy、8.5Gy、10.0yG、11.5Gy、13.0Gy五個(gè)劑

5、量腹部局部照射。觀察輻照后30天內(nèi)各組小鼠的存活率,根據(jù)存活率、小腸病理切片及輻照后小鼠的活動(dòng)表現(xiàn),選擇10Gy作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的照射劑量。
　　二、臍帶(umbilical cord, UC)源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、誘導(dǎo)鑒定：
　　無菌收集剛出生胎兒臍帶組織,去除動(dòng)靜脈,剩余臍帶結(jié)締組織成分,從源頭上純化細(xì)胞。將臍帶剪碎成2cm3左右大小的小塊,植入培養(yǎng)皿內(nèi),五天左右可見組織塊邊緣有少量貼壁的細(xì)胞爬出。換液,去除懸浮細(xì)胞,

6、10天左右吸去組織塊,待細(xì)胞長至80％融合,消化傳代。傳代過程中細(xì)胞得到進(jìn)一步純化,細(xì)胞呈典型的長梭型,貼壁生長,我們?nèi)?-5代的細(xì)胞誘導(dǎo)成骨、成脂分化。成骨誘導(dǎo)14天茜素紅染色,鏡下可見染成紅色的明顯的鈣節(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)第8天油紅O染色,鏡下可見被染成橘紅色的脂滴。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征及誘導(dǎo)分化能力,證明我們分離的細(xì)胞即為MSCs。
　　三、MSCs低氧條件培養(yǎng)液的制備：
　　選3-5代MSCs接種到培養(yǎng)瓶中,低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小

7、時(shí),收集培養(yǎng)上清,Elisa測(cè)低氧與非低氧對(duì)照組細(xì)胞因子含量。3KD超濾管超濾濃縮,得MSCs分泌因子大分子組分。用于后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。
　　四、MSCs及其低氧分泌大分子成分對(duì)輻照致腸損傷小鼠的保護(hù)作用：
　　40只Balb/C小鼠按平均體重每組10只分為照射對(duì)照、MSCs、單次MSCs分泌大分子、多次MSCs分泌大分子四組。40只小鼠進(jìn)行腹部局部10Gy60Coγ射線照射,照射結(jié)束1h內(nèi)各組分別給予相應(yīng)治療。觀察急性期內(nèi)小

8、鼠腹瀉率,記錄30天內(nèi)小鼠的存活情況、體重變化、測(cè)小鼠外周血象。結(jié)果顯示連續(xù)多次給予 MSCs分泌大分子成分能明顯減少小鼠腹瀉,對(duì)小鼠體重及外周血也有一定的改善作用,30天內(nèi)小鼠未出現(xiàn)死亡情況。
　　五、小腸病理學(xué)改變：
　　實(shí)驗(yàn)分照射對(duì)照組、MSCs組、多次MSCs分泌大分子組,每組40只小鼠,各組小鼠接受8.5Gy60Coγ射線腹部局部照射,照后1、3、7、11、21、30、60天各時(shí)間點(diǎn)各組活殺5只小鼠取空腸,福爾馬林