小鼠配對免疫球蛋白樣受體及其介導(dǎo)的T細(xì)胞階聯(lián)與樹突狀細(xì)胞免疫耐受作用關(guān)系的研究.pdf

1、移植物抗宿主病(GVHD)仍然是臨床骨髓移植治愈血液系統(tǒng)惡性疾病的主要障礙之一。供者異基因淋巴細(xì)胞的異?；罨荊VHD發(fā)生、發(fā)展的重要因素，誘導(dǎo)受者產(chǎn)生針對供者異基因主要組織相容性抗原(MHC)特異性耐受是預(yù)防GVHD、保存GVL的最佳途徑。配對免疫球蛋白樣受體(Paired immunoglobin-like receptor，PIR)是近年發(fā)現(xiàn)的主要表達(dá)在小鼠樹突狀細(xì)胞(DCs)上的免疫抑制性調(diào)節(jié)受體，包括免疫抑制性受體(PIR-B

2、)及免疫活化性受體(PIR-A)，其配體均是MHC-Ⅰ，二者與其配體的結(jié)合的水平是決定DCs免疫活化程度的重要分子標(biāo)志之一。由于DC不僅是調(diào)控體內(nèi)T細(xì)胞活化的關(guān)鍵，也是誘導(dǎo)免疫耐受的理想的靶細(xì)胞，可以直接或間接通過誘導(dǎo)供者抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成、在體內(nèi)形成T細(xì)胞階聯(lián)效應(yīng)而抑制異基因T淋巴細(xì)胞的活化，因此研究PIR在樹突狀細(xì)胞的表達(dá)、T細(xì)胞階聯(lián)的關(guān)系及與免疫耐受的關(guān)系，可能為誘導(dǎo)供者M(jìn)HC特異性耐受，實(shí)現(xiàn)GVHD及GVL的分離提供新

3、的途徑。
　　 第一部分
　　 目的：配對的免疫球蛋白樣受體A、B(paired immunoglobulin-like receptor A、B，PIR-A、PIR-B)屬于小鼠免疫球蛋白超家族成員。研究配對免疫球蛋白樣受體PIR-A、B在小鼠DCs上的表達(dá)及與表面共刺激分子變化的關(guān)系，探討PIR與免疫耐受的關(guān)系，探索誘導(dǎo)耐受性DCs的有效途徑。
　　 方法：以C57BL/6小鼠來源DC系DC2.4細(xì)胞為研究對

4、象，分別以重組小鼠白介素-10(recombinant mouse interleukin-10，rmIL-10)、重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1 (recombinant human transforming growth factorβ1，rhTGF-β1)誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞為耐受性DC(tolerogenic DC，T-DC)，脂多糖(LPS)刺激48h為成熟DC2.4細(xì)胞(LPS-DC)，體外化學(xué)合成特異PIR-B小RNA干擾片段(sm

5、all interfering RNA，siRNA)，以Lip2000轉(zhuǎn)染DC2.4細(xì)胞(Si-DC)。分別應(yīng)用半定量RT-PCR、流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)及Western blot檢測IL-10、TGF-β1、LPS及小干擾RNA對DC2.4細(xì)胞上PIR-A/B表達(dá)的影響；檢測LPS刺激Si-DCs后表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ及PIR-A的變化；以2-△△Ct表示各目的基因cDNA轉(zhuǎn)錄的相對

6、表達(dá)量。分別以上述各組DCs細(xì)胞為刺激細(xì)胞，以異基因BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，應(yīng)用3H-TdR標(biāo)記法檢測同種異體淋巴細(xì)胞的增殖能力(MLR)，ELISA方法測MLR上清中IFN-γ的分泌水平變化。
　　 結(jié)果：FCM檢測DC2.4細(xì)胞上PIR-A、PIR-B的共同的胞外區(qū)PIR表達(dá)的陽性率為(28.65±8.12)[％]，IL-10、TGF-β1及LPS誘導(dǎo)后PIR表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，分別為(54.21±6.

7、34)[％]，(58.78±4.70)[％]，(48.24±6.75)[％]，但I(xiàn)L-10、TGF-β1及LPS各組間無顯著性差別(P>0.05)。半定量RT-PCR及Western blot顯示，IL-10、TGF-β1誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞后PIR-B的mRNA及蛋白表達(dá)升高，而PIR-A表達(dá)則降低，而LPS刺激時(shí)則相反，PIR-A的mRNA及蛋白表達(dá)升高、PIR-B的表達(dá)則降低。流式細(xì)胞儀檢測SiRNA陽性對照組的轉(zhuǎn)染率為93.12[

8、％]，SYBR greenⅠRealtime-PCR檢測，LPS刺激后Si-DCs CD80、CD86、MHC-Ⅱ及PIR-A的表達(dá)高于正常DCs組。LPS-DCs組CD80、CD86、MHC-Ⅱ及PIR-A的2-△△Ct分別為5.02±1.09、4.69±1.75、5.46±1.79、6.02±2.13；LPS刺激后Si-DC組TAI分別為8.79±2.2、11.03±1.96、10.26±2.55、12.10±2.83，同LPS刺激

9、的正常組相比，Si-DC組分別增加了3.72、6.34、4.8、6.08倍(P<0.05)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)顯示：正常DC2.4細(xì)胞可刺激異基因淋巴細(xì)胞反應(yīng)，IL-10、TGFβ1誘導(dǎo)的T-DC組MLR明顯受抑(P<0.05)，MLR上清中IFN-γ水平也相應(yīng)降低(P<0.05)。LPS-DC及Si-DCs組MLR明顯增強(qiáng)(P<0.05)，MLR上清中IFN-γ水平明顯增高(P<0.05)；
　　 結(jié)論：上調(diào)免疫抑制性受體PIR

10、-B、下調(diào)活化性受體PIR-A是小鼠DCs獲得耐受的普遍表型特征及分子生物學(xué)機(jī)制，沉默PIR-B的表達(dá)可使PIR-A及CD80、CD86、MHC--Ⅱ及PIR-A過表達(dá)，使DCs活化的機(jī)制，PIR-A和PIR-B構(gòu)成了小鼠樹突狀細(xì)胞耐受的新靶點(diǎn)。
　　 第二部分
　　 目的：研究配對免疫球蛋白樣受體B在樹突狀細(xì)胞上表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成的關(guān)系，探討耐受性DCs誘導(dǎo)耐受的詳細(xì)機(jī)制，為體內(nèi)誘導(dǎo)耐受性DCs及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T

11、reg)生成提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：免疫磁珠分選BALB/c小鼠CD4+T脾淋巴細(xì)胞。以rmIL-10(50ng/ml)、rhTGF-β1(50ng/ml)聯(lián)合誘導(dǎo)C57BL/6小鼠來源的DC2.4細(xì)胞3天生成耐受性DCs(T-DC)，同時(shí)設(shè)正常DC2.4細(xì)胞(DC)及LPS刺激48h后成熟的DC2.4細(xì)胞(mDC)干擾PIR-B組(Si-DCs)為對照組，各組DCs分別與BALB/c小鼠CD4+T脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)48h，

12、檢測Treg生成。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)變化，流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例，PI檢測CD4+T細(xì)胞的凋亡。磁珠分選的CD4+CD25+Treg與CD4+T細(xì)胞按照不同的比例加入MLR體系中，3H檢測Treg對異基因DCs刺激的同基因淋巴細(xì)胞的增殖能力影響。
　　 結(jié)果：磁珠分選BALB/c小鼠脾CD4+T及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞純度>95[％]，正常DCs、T-DCs、Si-

13、DC及mDCs各組細(xì)胞同BALB/c小鼠脾細(xì)胞CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng)3天，RT-PCR檢測表明，T-DCs組誘導(dǎo)后CD4+T細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)明顯高于正常DCs、LPS-DC及Si-DC組。
　　 結(jié)論：誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成、促進(jìn)異基因淋巴細(xì)胞凋亡是PIR-B介導(dǎo)性DCs耐受的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用耐受性DCs誘導(dǎo)免疫耐受提供理論依據(jù)，也為Treg的誘導(dǎo)提供新的途徑。
　　 第三部分
　　 目的：誘導(dǎo)宿主產(chǎn)

14、生供者主要組織相容性抗原的特異性耐受是臨床骨髓移植的最終目標(biāo)，CD8+CD28-T(Ts)細(xì)胞是具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群之一，體外誘導(dǎo)異基因抗原特異性Ts生成，以研究Ts細(xì)胞與小鼠樹突狀細(xì)胞(DCs)上配對免疫球蛋白樣受體A和B表達(dá)的關(guān)系，探討其誘導(dǎo)免疫耐受的分子機(jī)制及特點(diǎn)，為臨床抗原特異性免疫治療的誘導(dǎo)提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：體外誘導(dǎo)Ⅰ類主要組織相容性抗原(H-2b)抗原特異性Ts細(xì)胞群，以C57BL/6小鼠(

15、H-2b)骨髓來源的樹突狀細(xì)胞系DC2.4細(xì)胞為刺激細(xì)胞，同BALB/c小鼠(H-2d)脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，連續(xù)兩次，每次培養(yǎng)7天，第10天于培養(yǎng)體系中加入IL-2(10u/ml)，第14天結(jié)束培養(yǎng)。以生物素標(biāo)記的CD28、CD8標(biāo)記上述細(xì)胞群，以鏈親和素標(biāo)記的免疫磁珠分兩步分選Ts細(xì)胞，首先負(fù)選CD8+T細(xì)胞，再正選CD28+T細(xì)胞，陰選細(xì)胞懸液為Ts細(xì)胞群。Ts同C57BL/6小鼠DC2.4(H-2b)細(xì)胞混合培養(yǎng)48h，RT-PC

16、R檢測DCs細(xì)胞PIR-A、PIR-BmRNA的表達(dá)，Westernblot檢測DCs細(xì)胞PIR-A、B的表達(dá)。3H標(biāo)記檢測混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(MLR)，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)KM鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，分別以DC2.4(H-2b)及第三者主要組織相容性抗原無關(guān)的KM供鼠DCs細(xì)胞為刺激細(xì)胞，以BALB/c小鼠來源的脾CD4+T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，加入Ts細(xì)胞，以CPM檢測異基因淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力。
　　 結(jié)果：體外以C57BL/6小

17、鼠DCs誘導(dǎo)并在體外應(yīng)用免疫磁珠分選的CD8+、CD8+CD28-Ts＞90[％]，以BALB/c小鼠Ts細(xì)胞(H-2d)與異基因C57BL/6小鼠DCs細(xì)胞(H-2b)混合培養(yǎng)48h后，RT-PCR及Western blot檢測PIR-BmRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)、PIR-A的mRNA及蛋白表達(dá)則下調(diào)。
　　 結(jié)論：體外誘導(dǎo)的Ts呈現(xiàn)Ⅰ類主要組織相容性抗原特異性抑制異基因反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的增殖。其機(jī)制與Ts細(xì)胞上調(diào)PIR-B mR