帶血管肌筋膜包埋脂肪干細胞載體復合物構(gòu)建血管化組織工程脂肪的實驗研究.pdf

1、[背景及目的]： 外傷、感染或腫瘤切除等各種原因造成機體局部皮膚軟組織的缺損，尤其是顏面部腫瘤或乳腺腫瘤的切除常致整個器官的缺失。這種器官的缺失及局部軟組織缺損所致的形態(tài)畸形和功能障礙，目前臨床上多以自體組織(皮瓣或肌皮瓣)及人工材料進行修復或充填，盡管這能有效地改善受區(qū)的組織缺損狀況，但它們均存在著許多眾所周知的缺點和不足。例如：自體組織的來源不足、皮瓣的血供問題以及由于供區(qū)損傷帶來的繼發(fā)性畸形等。因此，其臨床應用受到極大的限

2、制。此外，近年來還有其它多種多樣的方法也被嘗試，包括自體真皮移植，自體脂肪游離移植，膠原注射，人工材料充填等等。然而這些方法的治療效果也不十分理想：例如人工材料的移植排斥反應，游離脂肪移植后的吸收問題給治療效果帶來不可預知性等。盡管修復軟組織缺損的方法較多，卻難以完全滿足臨床的需要。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為臨床上更好的解決組織器官缺損等難題提供了一個全新的思路。 組織工程技術(shù)能以少量種子細胞，經(jīng)體外擴增后與生物材料復合植入體內(nèi)，修復

3、較大的組織或器官缺損，重建生理功能，為真正實現(xiàn)無損傷修復組織缺損和真正意義上的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能重建開辟了全新的途徑。組織工程學的發(fā)展需要幾個必備的因素，即：(1)可獲得的種子細胞，并能控制其生長和組織形成；(2)結(jié)構(gòu)精確的三維支架，以適合再造需要的組織量和形狀，而且與細胞具有良好的生物相容性；(3)適宜的微環(huán)境，能提供充分的血供和營養(yǎng)，維持細胞增殖和功能。 目前已證實脂肪組織中存在類似骨髓基質(zhì)細胞的間充質(zhì)干細胞，且被命名為脂肪組

4、織來源的干細胞(Adipose-deriredstemcells，ADSCs)。這種干細胞經(jīng)證實同樣具有體內(nèi)外多向分化潛能，如能向成熟脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞及心肌細胞定向轉(zhuǎn)化，對多種組織的損傷具有良好的修復作用，而且取材方便，獲取量大，不易造成供區(qū)繼發(fā)畸形等，有望成為組織工程研究中的重要種子細胞。 本課題研究了成年兔ADSCs向脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞的體外定向誘導分化能力，同時判斷ADSCs與海綿狀I(lǐng)型膠原

5、支架復合后的生物相容性；進而采用BrdU標記的ADCSs作為種子細胞，以海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白為支架，通過觀察帶血管肌筋膜包裹方法對移植物種子細胞的成活作用影響，以探討ADSCs-載體復合物在體內(nèi)成脂效應的理想途徑和構(gòu)建工程化、血管化的脂肪組織的適宜方法，為臨床上自體脂肪組織移植修復軟組織缺損及脂肪干細胞的有效移植提供理論依據(jù)。 [材料與方法]： 1、成年兔脂肪干細胞(ADSCs)的分離培養(yǎng)與鑒定 切取成年兔腹股溝皮

6、下脂肪墊，使用酶消化法進行原代細胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)及功能變化，細胞傳至第3代供實驗使用。采用細胞免疫熒光染色檢測細胞表面與干細胞相關(guān)的部分分子如CD29、CD34、CD44及CD49d，確定細胞類型：同時在體外對細胞進行向脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞誘導分化，并分別以油紅O染色、茜素紅染色及阿利辛藍染色進行定性鑒定。 2、BrdU體外脂肪干細胞標記及觀察標記物對細胞生物學性狀的影響 BrdU體外標記第3代AD

7、SCs，取P3代細胞以終濃度分別為5、10、15和20μmol／L的BrdU進行標記，分別記為A、B、C、D組；另一組不含BrdU，作為空白對照組E。標記12、24、48和72h后，采用免疫熒光染色法檢測各組細胞陽性標記率，以確定BrdU的最佳標記濃度及最佳標記時間；相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞生長情況及傳代后細胞標記率的變化；檢測ADSCs標記后向脂肪細胞分化的能力；使用MTT比色分析法檢測標記后細胞的增殖及毒性情況。 3、

8、成年兔ADSCs與海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白生物相容性的檢測 將標記后的P3代ADSCs與I型膠原蛋白海綿支架體外聯(lián)合培養(yǎng)，采用兩種不同的混合方法(細胞直接滴加于支架表面法和細胞注射于支架內(nèi)部法)，測定細胞在支架上的黏附率，相差顯微鏡及電子顯微鏡動態(tài)觀察細胞在支架上黏附、伸展、生長和增殖情況；檢測ADSCs與支架復合后向脂肪細胞分化的能力；使用MTT比色分析法檢測接種在支架的細胞的增殖情況。 4、帶血管肌筋膜包埋ADSCs-載體

9、復合物構(gòu)建血管化組織工程脂肪的體內(nèi)研究 經(jīng)解剖分離成年兔兩側(cè)背闊肌肌皮瓣，分離形成帶血管蒂的肌筋膜囊，分別包裹成脂誘導前、后的ADSCs與I型膠原蛋白載體復合物(A組，n=10和B組，n=10)，另將同樣大小的復合物植入同一動物右側(cè)臀大肌肌筋膜囊(無血管蒂)作為對照組(C組，n=10)；而空支架組(D組)即不含細胞成份的空支架植入兔左側(cè)臀大肌肌筋膜囊，各組實驗均采用自身對照。術(shù)后8w取材，經(jīng)油紅O染色、HE染色和免疫組織熒光染色

10、確定新生組織的性質(zhì)；測定三組新生組織的濕重和微血管密度，分析評價帶血管肌筋膜包裹方法對促進移植物血管化與種子細胞成活的影響。 [結(jié)果]： 1.原代培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)類似于成纖維細胞，具有很強的增殖及多向分化能力。分別在脂肪細胞誘導分化培養(yǎng)基、成骨細胞誘導分化培養(yǎng)基及軟骨細胞誘導分化培養(yǎng)基的作用下，能分化出成熟的脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞；分別以油紅O染色、茜素紅染色及阿利辛藍染色呈陽性。免疫熒光檢測到細胞表面抗原分子

11、CD29、CD44、CD49d表達呈陽性。 2.第3代ADSCs經(jīng)BrdU標記后進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下胞核呈綠色熒光?？偟目磥?，隨著標記時間的延長和BrdU劑量的增加，標記率逐漸增高，BrdU終濃度為15μmol／L且標記48h后細胞標記率>90％，但標記時間繼續(xù)延長和8rdU濃度繼續(xù)增加，細胞標記率無明顯增高。經(jīng)統(tǒng)計分析表明BrdU標記ADSCs的最佳終濃度為15μmol/L，最佳標記時間為48h。與正常未標記細胞比

12、較，標記后細胞的形態(tài)及生長增殖狀況無明顯差別，活細胞數(shù)>98％。細胞標記后不影響向脂肪細胞分化的能力。 3.ADSCs可以在海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白支架上生長并逐漸黏附，細胞未經(jīng)成脂誘導前，ADSCs與支架的混合方式不同，細胞在支架上的黏附率也不同：ADSCs在支架表面滴加組(A組，n=6)的細胞黏附率為79.5％±2.5％；ADSCs在支架內(nèi)部注射組(B組，n=6)的細胞黏附率92.7％±2.2％，A、B兩組采用獨立樣本t檢驗比較差

13、異有統(tǒng)計學意義(t=6.965，P=0.002)。而ADSCs成脂誘導后注射于支架內(nèi)部的黏附率為91.3％±1.5％(C組，n=6)，B、C兩組采用獨立樣本t檢驗比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.889，P=0.424)。ADSCs與支架混合培養(yǎng)后不影響細胞的形態(tài)、生長增殖狀況，對細胞無毒性反應；細胞與支架復合后不影響向脂肪細胞分化的能力。 4.術(shù)后8W取材發(fā)現(xiàn)，A、B、C三組于移植物包埋區(qū)均可觀察到新生組織形成；空白對照組(D組)

14、未見新生組織形成。A組(n=10)新生組織平均濕重為0.0230g±0.0016g；B組(n=10)新生組織平均濕重為0.0251g±0.0019g；C組(n=10)新生組織平均濕重為0.0202g±0.0014g，A組與B組、B組與C組及A組與C組之間濕重比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。HE染色及油紅O染色均證實新生組織為成熟脂肪組織，膠原支架已完全吸收降解；免疫熒光染色陽性證實新生組織為外源性。各組新生微血管密度分別為：A

15、組(n=10)28.5±3.7：B組(n=10)31.2±4.5；C組(n=10)19.3±2.6；A與C，B與C之間新生微血管密度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。 [結(jié)論]： 1、本實驗成功地從成年兔皮下脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪干細胞(ADSCs)。建立了一整套有關(guān)ADSCs分離、培養(yǎng)和鑒定的較簡便的方法。ADSCs具有很強的增殖和自我更新能力。ADSCs具有向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的潛能。ADSC

16、s來源豐富、取材容易，創(chuàng)傷小，是理想的組織工程種子細胞，具有廣闊的應用前景。 2、BrdU標h3ADSCs的最佳時間為48小時；最佳終濃度為15μmol／L；標記陽性率>90％。BrdU對細胞無毒副作用，安全性高，對細胞的生長增殖及成脂分化無明顯影響。 3、ADSCs可以在海綿狀I(lǐng)型膠原蛋白支架上逐漸黏附，細胞黏附率高，生長、增殖良好。支架對細胞無毒性反應。膠原蛋白材料與ADSCs之間具有良好的生物相容性。 4、