（一）豬鼻支原體免疫膠體金快速檢測卡的研制;（二）抗念珠狀鏈桿菌單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、膠體金免疫層析檢測(gold immunochromatography assay,GICA)，以其特異、敏感、快速的優(yōu)點，廣泛應用于病原微生物的流行病學調查和感染性疾病的臨床診斷。本研究根據豬鼻支原體感染在人體血清抗體效價不高，其病原體在人體腔道寄生的特點，確定雙抗體夾心法診斷抗原的GICA檢測模式。以特異性和敏感性較高的配對單克隆抗體(McAb)作為診斷試劑，然后進行條件篩選和優(yōu)化建立GICA檢測卡(GICAs)，結果如下：

2、 首先，層析材料的制備和選擇。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，調節(jié)還原劑的用量可得到不同粒徑的膠體金，可見光光譜掃描鑒定表明顆粒均勻，粒徑大小符合理論值。選擇合適粒徑的膠體金標記McAb，即為金標抗體，另一株McAb為包被抗體；對診斷試劑和層析材料通過層析性能和應用效果兩方面進行篩選，確定緩沖液環(huán)境，抗體工作濃度等。 其次，GICA的建立和在夾心模式下的整體優(yōu)化實驗，降低檢測限，減少非特異性反應，提高穩(wěn)定性。 最后，

3、GICA應用的初步評價。檢測豬鼻支原體4d的液體培養(yǎng)物，其檢測限為1.72×10<'3>CFU/mL，檢測全菌蛋白檢測限為50ng/100μL；特異性試驗表明與實驗動物和人易感11種細菌和11種支原體均無交叉反應。陽性結果可在5min內判定，弱陽性結果需時約10min。批內重復性和批間重復性好，穩(wěn)定性試驗結果表明其4℃保存6個月以上在檢測限以上仍能得到清晰的陽性結果。 本文研制的GICAs檢測豬鼻支原體特異性強、靈敏度高，操作簡

4、單、結果快速，可用于感染的流行病學調查和臨床診斷。 目前國內外尚缺乏針對SM的快速檢測試劑盒，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法需時較長且該菌易形成L形變異，PCR方法檢測步驟較為繁瑣且容易受條件限制，均不適用于實驗動物隱性感染和臨床感染病例的快速診斷。本文以經典的細胞融合技術制備抗SM單克隆抗體，為進一步建立以血清學診斷試劑為基礎的快速檢測方法奠定基礎。 首先，抗SM單克隆抗體的制備。以SM全菌蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠，經過基

5、礎免疫、加強免疫3次以上，待免疫血清抗體效價達到l：10<'5>以上后進行沖擊免疫，3天后取脾細胞，與處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞融合，以甲基纖維素半固體法進行克隆，亞克隆3次，以間接ELISA方法對克隆后的細胞株進行篩選，最后共篩選出12株分泌抗體陽性的融合細胞株。 其次，抗SM單克隆抗體的鑒定。通過染色體計數(shù)試驗證明12株細胞皆為雜交瘤細胞；亞類測定證實其分屬于IgG<,1>、IgG<,2a>、IgG<,2b>以及IgM類

6、；Westem-blot實驗表明單抗5G4結合的抗原分子量為32x 10<'3>，6D10結合的抗原分子量為66x10<'3>，5B9結合的抗原分子量有2個條帶，在60-67×10<'3>之間，為SM種特異性抗原；IFA結果顯示，單抗5G4能夠與SM表面抗原結合；ELISA實驗初步表明單抗5G4與實驗動物常見病原菌無交叉反應，提示單抗5G4有可能作為診斷抗體直接檢測抗原或者作為診斷抗原純化的親和層析配體。在后續(xù)SM血清學診斷方法的研究中