PRP聯(lián)合BMSCs負(fù)載改建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)作用的研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管，一旦受損依靠自身能力修復(fù)非常困難，而臨床使用的外科治療方法難以獲得長期確切療效，近年來隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)效果達(dá)到了新的高度。現(xiàn)階段組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究雖已取得很大進(jìn)展，但大多停留于實驗探索階段，即尋找能夠兼顧材料學(xué)和生物科學(xué)的需要的修復(fù)材料，使組織工程軟骨能夠更接近機體自身組織生物學(xué)特性。軟骨組織工程涵蓋種子細(xì)胞、支架材料、生物因子及組織構(gòu)建等多方面的考慮與選擇，是一項復(fù)雜而精密的

2、系統(tǒng)工程。本研究以兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為種子細(xì)胞，改建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)作為軟骨組織工程的支架材料，以自體富血小板血漿(PRP)作為生長因子的來源，首次利用PRP-BMSCs-ADM支架復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨，觀察其對骨軟骨缺損的治療效果，為組織工程修復(fù)骨軟骨缺損尋找一種新的方法。
　　第一部分:脫細(xì)胞真皮基質(zhì)三維支架的制備及特性研究
　　目的: 評估改建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)三維多孔支架的制備方法及其特性研

3、究。
　　方法: 首先選取新生小牛背部真皮組織，采用Courtman改良法處理細(xì)胞，冷凍干燥后采用京尼平對三維支架進(jìn)行交聯(lián)，制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)三維多孔支架;再次對支架材料進(jìn)行冷凍干燥，然后對其進(jìn)行大體及掃描電鏡觀察;分別測定支架材料的空隙直徑、孔隙率、吸水率、降解率;其次，提取、分離、培養(yǎng)2月齡新西蘭大白兔BMSCs，采用MTT法檢測BMSCs在支架材料上的生長、增殖情況。
　　結(jié)果: 測量示支架空隙直徑為支架孔隙直徑為(1

4、01.2±9.3)um，孔隙率為88.6％±2.7％，降解率2周為(13.83±7.12)％，4周為(25.66±8.19)％。MTT法顯示細(xì)胞在支架上生長良好，與對照組相比，吸光度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，提示支架相容性良好，無細(xì)胞毒性。
　　結(jié)論: 經(jīng)Courtman改良法處理的真皮基質(zhì)三維多孔支架脫細(xì)胞更徹底，保留了天然細(xì)胞外基質(zhì)成分，天然交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)后支架材料機械強度和抗降解性得到了提高。
　　第二部分

5、:PRP聯(lián)合改建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)負(fù)載BMSC對兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)作用的研究
　　目的: 探討自體富血小板血漿(PRP)聯(lián)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)復(fù)合改建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的可行性。
　　方法: 首先制備PRP，提取、分離、培養(yǎng)2月齡新西蘭大白兔BMSCs，調(diào)整BMSCs細(xì)胞密度為6×105個/ml后接種于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)支架上，其中實驗組的培養(yǎng)基中加入10％PRP，掃描電鏡和MTT法觀測細(xì)胞在支架上增

6、殖情況。最后，取3月齡清潔級新西蘭大白兔27只，雌性，2.4±0.2kg，隨機分為3組，即A組:空白對照組（僅髁部造缺損）、B組:BMSCs+ADM覆蓋、C組:PRP+ADM+BMSCs，體外培養(yǎng)1周后將細(xì)胞-支架復(fù)合物植入植入兔股骨髁軟骨缺損處，分別在4、8、12周后取材對構(gòu)建的組織工程軟骨進(jìn)行ICRS評分及組織學(xué)、免疫化學(xué)、生物力學(xué)檢測。
　　結(jié)果: MTT法檢測顯示，體外培養(yǎng)3～11d時實驗組支架上細(xì)胞增殖數(shù)量多于對照組(p

7、＜0.05）。經(jīng)過最長12周培養(yǎng)后取材進(jìn)行組織學(xué)、免疫化學(xué)檢測，結(jié)果顯示PRP+ADM+BMSCs組軟骨缺損獲得了更為滿意的修復(fù)效果:關(guān)節(jié)表面平坦光滑，與周圍組織未見明顯界限;組織學(xué)染色證實軟骨基質(zhì)分泌旺盛并有典型軟骨細(xì)胞形成，組織結(jié)構(gòu)類似正常關(guān)節(jié)軟骨，PRP+ADM+BMSCs組術(shù)后第4、8、12周ICRS評分均高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　結(jié)論: ADM孔隙均勻，組織相容性好，適于細(xì)胞粘附及長期生長，