甲醛誘導(dǎo)下易誤性跨損傷合成DNA聚合酶ζ及Rev1的表達(dá)改變.pdf

1、本研究以甲醛為研究對(duì)象，通過(guò)MTT法確定甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)的劑量-反應(yīng)關(guān)系，用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)甲醛的遺傳毒性，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同劑量毒物刺激下revl、rev3、rev7基因的表達(dá)改變，Westernblot方法檢測(cè)Rev1、Rev3、Rev7蛋白的表達(dá)改變，從而探討在不同劑量水平甲醛作用下，易誤性跨損傷合成聚合酶ζ及相關(guān)因子Rev1的表達(dá)改變及其聯(lián)系，為進(jìn)一步研究跨損傷合成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。 研

2、究材料和方法： 1.MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖功能，確定實(shí)驗(yàn)分組采用噻唑藍(lán)顏色反應(yīng)法(MTT法)。作出甲醛誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線。參考文獻(xiàn)資料以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定各實(shí)驗(yàn)組甲醛染毒劑量。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期按照確定的劑量對(duì)16HBE細(xì)胞進(jìn)行染毒4小時(shí)后，終止染毒，收集細(xì)胞，用80％酒精固定過(guò)夜，送中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 3.單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷

3、培養(yǎng)16HBE細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，甲醛染毒4小時(shí)，染毒結(jié)束后，去含甲醛的培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，再加入完全培養(yǎng)基，將各組細(xì)胞置于15W紫外燈40cm下紫外線照射5分鐘，同時(shí)設(shè)紫外線照射5分鐘的對(duì)照組和陰性對(duì)照組，最后收集細(xì)胞，通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)不同劑量組細(xì)胞DNA損傷情況，測(cè)量彗星尾長(zhǎng)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定各劑量組甲醛對(duì)16HBE細(xì)胞的遺傳毒性。 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞rev1、rev3、rev7在mRNA水平的表

4、達(dá)變化。 4.1：16HBE細(xì)胞總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成培養(yǎng)16HBE細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，甲醛染毒4小時(shí)，染毒結(jié)束后后，2.5mg/L胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，用BBI公司的ClassicalTotalRNAIsolationKit進(jìn)行總RNA的提取。取提取出的RNA4μ1溶液在1％瓊脂糖凝膠中電泳鑒定所提取RNA的完整性，并用核酸定量?jī)x測(cè)定純度。RNA純度符合RT-PCR要求的(A260nm/A280nm值在1.8-

5、2.0范圍內(nèi))，用Fermentas公司的FirstStrandcDNASynthesisKit進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。將合成的cDNA置于-20℃保存。 4.2：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rev1、rev3、rev7在mRNA水平的表達(dá)改變。 根據(jù)rev1、rev3、rev7基因的cDNA序列各設(shè)計(jì)一對(duì)引物，內(nèi)參B-actin的引物參考文獻(xiàn)合成。將上述制備的各組cDNA樣品在MX4000熒光定量PCR儀上擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置無(wú)

6、模板對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所用的試劑盒為Stratagene公司的BrilliantSYBRGreenQPCRMasterMix。 4.3電泳鑒定PCR產(chǎn)物。 取6μlPCR產(chǎn)物上樣在1.5％的瓊脂糖凝膠上，在0.5×TBE緩沖液中，120V恒壓電泳40min，鑒定PCR產(chǎn)物。 5.Westerblot檢測(cè)各組細(xì)胞Rev1、Rev3、Rev7在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)改變培養(yǎng)16HBE細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，甲醛染毒4小時(shí)后，終

7、止染毒，提取總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)一步對(duì)各劑量組蛋白做SDS-PAGE電泳，以GADPH作為內(nèi)參照。掃描圖像輸入電腦，ImageTool凝膠分析軟件分析圖像。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS10.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.MTT法檢測(cè)結(jié)果： 1.1支氣管上皮細(xì)胞16HBE在甲醛染毒下的劑量-反應(yīng)關(guān)系當(dāng)甲醛濃度低于0.01mmol/

8、L時(shí)，細(xì)胞存活率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨甲醛濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，當(dāng)濃度達(dá)到0.5mmol/L以上時(shí)，細(xì)胞存活率的降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；甲醛的半數(shù)抑制濃度(IC50)約1mmol/L。 1.2各試驗(yàn)組甲醛的確定根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，參考文獻(xiàn)及其預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)分7個(gè)劑量組，各劑量組甲醛染毒濃度分別是0.001mmol/L、0.010mmol/L、0.025mmol/L、0.050mmol/L、0.100

9、mmol/L、0.500mmol/L、1mmol/L，另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與空白對(duì)照比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示細(xì)胞周期無(wú)明顯改變，未出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。 3.單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷甲醛染毒劑量在0.001mmol/L-0.01mmol/L之間，彗星尾長(zhǎng)隨著劑量的增加而增大；甲醛染毒劑量在0.01mmol/L-1mmol/L之間，彗星尾長(zhǎng)隨著劑量的增加而減?。划?dāng)甲醛染毒劑量≥1mm

10、ol/L時(shí)，彗星尾長(zhǎng)與空白對(duì)照組相比較差別已經(jīng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rev1、rev3、rev7基因在各組樣品中的表達(dá)隨著甲醛染毒劑量的增加，16HBE細(xì)胞中rev1、rev3、rev7的表達(dá)出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)：甲醛濃度在0-0.5mmol/L時(shí)，上述基因的表達(dá)隨著劑量增大而增加；當(dāng)甲醛濃度大于0.5mmol/L時(shí)，上述基因的表達(dá)隨甲醛劑量增大而減少。 5.Westernblot檢測(cè)Rev1、R

11、ev3、Rev7蛋白在各組樣品中的表達(dá)將Westernblot結(jié)果膠片進(jìn)行掃描，以ImageTool凝膠分析軟件分析蛋白印跡灰度值發(fā)現(xiàn)，甲醛濃度在0-0.5mmol/L時(shí)，Rev1、Rev3、Rev7蛋白圖像的灰度逐漸增加，甲醛濃度在0.5mmol/L時(shí)，Rev1、Rev3、Rev7蛋白圖像的灰度開(kāi)始降低。表明Rev1、Rev3、Rev7蛋白在各組樣品中的表達(dá)改變與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的mRNA表達(dá)改變具有一致性。 研究結(jié)論：

12、 1.應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DNA損傷表明，甲醛在不同劑量時(shí)導(dǎo)致不同類型的DNA損傷。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，表明在低劑量時(shí)，甲醛引起的DNA損傷主要以DNA斷裂為主；在較高劑量時(shí)，隨著劑量增大，甲醛引起DNA交聯(lián)的作用不斷增加。本研究中發(fā)現(xiàn)，甲醛在低于0.01mmol/L時(shí)，引起的16HBE細(xì)胞DNA損傷可能主要以斷裂為主；高于0.01mmol/L時(shí)，則以DNA交聯(lián)為主。 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果表明，較低劑量甲醛

13、染毒(≤0.01mmol/L)引起DNA斷裂時(shí)，易誤性跨損傷合成DNA聚合酶ζ的表達(dá)隨著劑量增加而增加，提示DNA聚合酶ζ參與DNA斷裂的跨損傷合成；當(dāng)較高劑量甲醛染毒(＞0.01mmol/L)引起DNA交聯(lián)時(shí)，DNA聚合酶ζ表達(dá)出現(xiàn)先上升后下降，提示DNA聚合酶ζ可能在一定程度上也參與了DNA交聯(lián)的跨損傷合成。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)的結(jié)果也支持以上結(jié)論。 3.rev1與rev7、rev3的表達(dá)具有一致性，提示rev