ZHJ-MAPCs的細(xì)胞學(xué)初步分析鑒定及共培養(yǎng)誘導(dǎo)向肝樣細(xì)胞分化研究.pdf

1、治療終末期肝病最有效的方法之一就是原位肝移植(orthotopiclivertransplantation，OLT)，然而，由于供體的缺乏、免疫排斥和高額費(fèi)用等問題，OLT的廣泛應(yīng)用受到了限制。肝細(xì)胞移植(hepatocytestransplantationHCT)經(jīng)過近30年的發(fā)展，正由動物實(shí)驗(yàn)向臨床過渡，初步結(jié)果顯示，肝細(xì)胞移植在急慢性肝衰竭和遺傳代謝性肝病方面具有很好的應(yīng)用前景，但同樣面臨肝細(xì)胞來源有限，排斥反應(yīng)等問題的困擾。雜交

2、型生物人工肝(Hybridbioartificialliver,HBAL)治療可以使終末期肝病病人橋接(bridge)肝移植，而且由于肝細(xì)胞具有強(qiáng)大的再生能力，臨時(shí)應(yīng)用生物人工肝也可以暫時(shí)代償肝功能，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，部分患者肝功能完全恢復(fù)正常。但作為HBAL核心生物材料的肝細(xì)胞來源問題未得到根本解決，使HBAL的臨床應(yīng)用遠(yuǎn)未達(dá)到理論上的預(yù)期效果。研究證明人骨髓來源的多能成體祖細(xì)胞(Multipotentadultprogenitorce

3、llsfrombonemarrow，MAPCs)具有向肝樣細(xì)胞分化的潛能，由于其具有易于增殖、調(diào)控、供源豐富、容易獲取、有自體供源避免免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)，有望成為理想的組織工程細(xì)胞來源。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過密度梯度離心—貼壁培養(yǎng)篩選—免疫磁性雙陰性分選(magneticactivatedcellsorting，MACS)三個(gè)步驟高效率地純化分選出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)亞群MAPCs(CD45-

4、，GlyA-)，并將之命名為ZHJ-MAPCs(Zhujiang-MAPCs)。通過改良細(xì)胞培養(yǎng)基等方法，我們建立了ZHJ-MAPCs的傳代培養(yǎng)技術(shù)(結(jié)果尚未發(fā)表)。 第一部分：ZHJ-MAPCs特征表型及細(xì)胞遺傳學(xué)初步分析鑒定目的對經(jīng)過CD45、GlyA免疫微磁珠體外負(fù)分選純化并傳代培養(yǎng)的ZHJ-MAPCs進(jìn)行體外部分細(xì)胞學(xué)鑒定，了解其特異性標(biāo)志物表達(dá)及增殖、傳代過程中的遺傳學(xué)穩(wěn)定性。 方法(1)取原代凍存的經(jīng)過CD4

5、5、GlyA免疫微磁珠體外負(fù)分選純化的人ZHJ-MAPCs復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代后進(jìn)行CD29、CD44、CD34和HLA-DR流式細(xì)胞分析，初步了解ZHJ-MAPCs特異性表型的表達(dá)情況。(2)分別在傳至第6代和第13代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞核型分析了解細(xì)胞核型變化。 結(jié)果(1)流式細(xì)胞儀檢測ZHJ-MAPCs中CD29陽性表達(dá)細(xì)胞比率為99.2％，CD44陽性細(xì)胞比率為98.3％，CD34陽性細(xì)胞比率為1.2％，HLA-DR陽性細(xì)胞比率為5.3

6、％。(2)ZHJ-MAPCs在增殖傳代過程中表現(xiàn)出非正常二倍體特征，染色體干系數(shù)目在第6、13代均為55～58條，占80％，染色體數(shù)介于超二倍體和亞三倍體之間，鏡下見細(xì)胞均發(fā)生染色體變異，且變異形態(tài)多樣。 結(jié)論(1)ZHJ-MAPCs具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特征及較高的純度。(2)ZHJ-MAPCs在增殖傳代過程中表現(xiàn)出非正常二倍體特征，染色體數(shù)介于超二倍體和亞三倍體之間，染色體變異形態(tài)多樣。 第二部分：ZHJ-MAPCs

7、與人肝細(xì)胞系L02體外共培養(yǎng)向肝樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究目的探索人骨髓來源ZHJ-MAPCs在與人肝細(xì)胞系L02在體外共培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的可行性，為其在組織工程學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法(1)間接共培養(yǎng)：將分別接種于蓋玻片上的第4代ZHJ-MAPCs和人肝細(xì)胞系L02(密度均為1×105/ml)按照各50％比例共置于直徑10cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液共通，實(shí)現(xiàn)間接共培養(yǎng)。分別于間接共培養(yǎng)第1、3、5、7天免疫細(xì)

8、胞化學(xué)鑒定ZHJ-MAPCs的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝細(xì)胞特征性表型表達(dá)變化情況，并設(shè)陽性對照(單獨(dú)培養(yǎng)的L02細(xì)胞)和陰性對照(單獨(dú)培養(yǎng)未經(jīng)誘導(dǎo)的ZHJ-MAPCs)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞比率；(2)直接共培養(yǎng)：將CFSE熒光(綠色)標(biāo)記的第4代ZHJ-MAPCs與L02(密度均為1×104/ml)按照各50％比例混合后接種于激光共聚焦顯微鏡檢查專用培養(yǎng)皿內(nèi)，實(shí)現(xiàn)直接共培養(yǎng)。5天后用SABC-Cy3免疫熒光(紅色)雙標(biāo)后在激

9、光共聚焦顯微鏡下分別觀察ZHJ-MAPCs表達(dá)ALB、AFP、CK-18的情況。同樣設(shè)陽性對照(單獨(dú)培養(yǎng)的CFSE標(biāo)記L02細(xì)胞)和陰性對照(單獨(dú)培養(yǎng)的CFSE標(biāo)記ZHJ-MAPCs)。 結(jié)果(1)間接共培養(yǎng)結(jié)果：AFP作為不成熟肝細(xì)胞的表型標(biāo)志，間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)的ZHJ-MAPCs在間接共培養(yǎng)第1天表現(xiàn)為強(qiáng)陽性表達(dá)，隨后表達(dá)逐漸減弱，至第7天，AFP的陽性表達(dá)已經(jīng)很少。而ALB在第1天有可疑陽性表達(dá)，間接共培養(yǎng)第3天，ALB即出

10、現(xiàn)較強(qiáng)的陽性表達(dá)，第5天，ALB的陽性表達(dá)既達(dá)到高峰，第7天，密集生長的細(xì)胞仍廣泛的陽性表達(dá)ALB。間接共培養(yǎng)第1、3天檢測CK-18均為陰性，至第5天CK-18開始出現(xiàn)陽性表達(dá)，第7天CK-18陽性表達(dá)較前增強(qiáng)。CK-19在各時(shí)間點(diǎn)均為陰性著色。陽性對照細(xì)胞ALB及CK18有較強(qiáng)的陽性表達(dá)，AFP弱陽性表達(dá)，CK19陰性表達(dá)。陰性對照細(xì)胞均為陰性表達(dá)。(2)直接共培養(yǎng)結(jié)果：CFSE熒光標(biāo)記的ZHJ-MAPCs和L02直接共培養(yǎng)，在第5

11、天行SABC-Cy3免疫熒光染色后行激光共聚焦顯微鏡掃描，結(jié)果鏡下表達(dá)黃色熒光的細(xì)胞即是向肝細(xì)胞分化的ZHJ-MAPCs，為陽性細(xì)胞；單純表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞為未分化的ZHJ-MAPCs；單純表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞為L02細(xì)胞。結(jié)果ALB和CK18檢測時(shí)，較多細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色熒光表達(dá)，而AFP陽性熒光表達(dá)則僅出現(xiàn)在極個(gè)別細(xì)胞漿內(nèi)，該結(jié)果與陽性對照細(xì)胞熒光表達(dá)類似，而陰性對照細(xì)胞未見有陽性熒光表達(dá)。 結(jié)論(1)與人肝細(xì)胞系L02間接共