瘦素信號(hào)通路及脂聯(lián)素信號(hào)通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、目的:
　　調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，糖尿病的發(fā)病率和患者數(shù)量在世界范圍內(nèi)迅速上升，估計(jì)到2030年全球糖尿病患者將接近5億，其中2型糖尿病是最主要和增長(zhǎng)最快的糖尿病類型，占整個(gè)糖尿病人群的90％以上，我國(guó)已成為世界上糖尿病患病數(shù)最多的國(guó)家，2型糖尿病也已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，給社會(huì)、經(jīng)濟(jì)以及人們的健康帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。但由于病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，使得對(duì)2型糖尿病的預(yù)防和治療存在較大困難。
　　近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的遺

2、傳流行病學(xué)研究，希望找到2型糖尿病的易感基因，以更好地理解其遺傳學(xué)基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制。截至目前，主要有以下幾種遺傳流行病學(xué)的研究策略和方法用于2型糖尿病易感基因的定位和識(shí)別:
　　(1)連鎖分析:連鎖分析是較早用于定位2型糖尿病易感基因的方法。目前，已在20多個(gè)種族人群（如芬蘭人、墨西哥裔美國(guó)人、美國(guó)白人、英國(guó)人、日本人、法國(guó)人、中國(guó)北方和南方漢族人等）中進(jìn)行全基因組掃描及微衛(wèi)星標(biāo)記與2型糖尿病的連鎖分析，結(jié)果顯示2型糖尿病的易感位點(diǎn)

3、位于多條染色體上，并且在多個(gè)人群中得到驗(yàn)證。
　　(2)候選基因關(guān)聯(lián)研究:候選基因關(guān)聯(lián)研究是根據(jù)某些間接線索（如連鎖分析的結(jié)果或者基因表達(dá)產(chǎn)物的功能信息等）選定一個(gè)或幾個(gè)候選基因，借助于直接測(cè)序或等位基因特異性擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)在病例和對(duì)照中比較候選基因序列差異，來(lái)確定這些候選基因與患病狀態(tài)或數(shù)量性狀間是否存在關(guān)聯(lián)。自20多年前第一篇胰島素基因與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究發(fā)表以來(lái)，與胰腺發(fā)育的分子機(jī)制、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島素分泌等有關(guān)

4、的2型糖尿病的候選基因明顯增多，但小型的候選基因關(guān)聯(lián)研究的結(jié)果可重復(fù)性較差，僅PPARG和KCNJ11得到較好的重復(fù)。
　　(3)全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study，GWAS):它以人類基因組中數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的SNP為標(biāo)記進(jìn)行病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析，以期發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜疾病相關(guān)的遺傳變異。自2007年Sladek等在Nature上發(fā)表第一篇關(guān)于2型糖尿病的全基因組關(guān)聯(lián)分析以來(lái)，在不同種族、不同人群中開(kāi)展

5、的2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)分析有30余項(xiàng)，報(bào)道的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)139個(gè)，被不同研究驗(yàn)證的60多個(gè)。這些發(fā)現(xiàn)為了解2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供了更多的線索，但是它們還是不能全面系統(tǒng)地闡釋2型糖尿病的遺傳機(jī)制，存在著嚴(yán)重的“遺失遺傳度”現(xiàn)象。這可能與全基因組關(guān)聯(lián)分析的局限性有關(guān)。針對(duì)這種情況，一些新的策略和方法已經(jīng)被嘗試應(yīng)用到GWAS的后續(xù)研究中，如基因-基因交互作用研究、基于通路的關(guān)聯(lián)分析等。
　　(4)基因-基因交互作用研究:基因-基因交互作

6、用主要指非等位基因間的相互作用，有的文獻(xiàn)中也稱上位效應(yīng)，它可能是導(dǎo)致復(fù)雜疾病的主要因素之一。復(fù)雜疾病大多受到微效基因的影響，這些影響更可能通過(guò)交互作用分析被檢測(cè)出來(lái)?；?基因交互作用研究不僅可以提高發(fā)現(xiàn)基因與疾病關(guān)聯(lián)的功效，而且有助于我們對(duì)與疾病相關(guān)生物學(xué)通路的理解。已發(fā)現(xiàn)UCP2和PPARγ基因中的兩位點(diǎn)互作與2型糖尿病關(guān)聯(lián)，與肥胖相關(guān)候選基因的SNP-SNP互作也可以增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。
　　(5)基于通路的關(guān)聯(lián)分析:通

7、路分析是近年來(lái)發(fā)展的基于先驗(yàn)知識(shí)的下游功能學(xué)分析方法，它以已有的先驗(yàn)通路（如KEGG、Biocarta和Gene Ontology等數(shù)據(jù)庫(kù)中的通路）中的基因集為分析單元，在基因集水平上尋找疾病關(guān)聯(lián)的通路及生物學(xué)功能，評(píng)估通路對(duì)疾病風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)。以功能相關(guān)的基因集為分析單元符合復(fù)雜疾病的多基因遺傳特性，一方面可以起到降維的目的，減少多重比較的次數(shù)，增加了檢驗(yàn)效能，另一方面考慮了同一功能基因集中基因間的相互作用，并把復(fù)雜的基因互作看作一個(gè)整體

8、納入分析，能更好地識(shí)別互作效應(yīng)和挖掘出具備功能學(xué)意義的互作基因，所得結(jié)果也更具有生物學(xué)解釋能力。
　　在前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路可能是與2型糖尿病關(guān)聯(lián)較密切的一條通路。脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路包含3條子通路，其中瘦素(leptin，LEP)信號(hào)通路和脂聯(lián)素(adiponectin，ADIPO)信號(hào)通路一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。因此，本研究擬選取LEP信號(hào)通路和ADIPO信號(hào)通路進(jìn)行深入探討，分析基因中單個(gè)SNP

9、與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)、同一基因多個(gè)SNP的連鎖不平衡和LD block內(nèi)的單倍型、SNP-SNP的交互作用以及在通路水平上SNP集與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)，以期發(fā)現(xiàn)新的有意義的SNP位點(diǎn)、SNP對(duì)子和SNP組合，為進(jìn)一步研究2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制和尋找可能的藥物作用靶點(diǎn)提供線索，為個(gè)體2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)及早期干預(yù)提供依據(jù)。
　　方法:
　　本研究采用病例對(duì)照設(shè)計(jì)，病例為確診的2型糖尿病患者，來(lái)自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、茂名市人民醫(yī)院

10、、韶關(guān)市人民醫(yī)院、東莞市石龍博愛(ài)醫(yī)院、東莞厚街人民醫(yī)院、深圳龍華人民醫(yī)院、深圳市南山人民醫(yī)院、深圳市觀瀾人民醫(yī)院、深圳市西鄉(xiāng)人民醫(yī)院、深圳市福田人民醫(yī)院等10所醫(yī)院的內(nèi)分泌科。對(duì)照為與病例同時(shí)期在同一家醫(yī)院體檢的健康人群。按照所在地區(qū)和性別將病例組和對(duì)照組受試者進(jìn)行匹配。
　　由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員對(duì)符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的問(wèn)卷調(diào)查，內(nèi)容包括年齡、性別、籍貫、職業(yè)、疾病史、病程、吸煙史、家族史、并發(fā)癥、飲食及運(yùn)動(dòng)情況等。采取

11、受試者外周血，一部分用于生化檢測(cè)，一部分冷藏用于提取DNA。提取DNA后，用SNPscanTM多重SNP分型試劑盒對(duì)選擇的48個(gè)SNP——LEP通路中15個(gè)基因(LEP、LEPR、JAK1、JAK2、STAT3、SHP-2、PPARGC1A、PRKAA1、PRKAA2、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3、alpha-MSH、NPY)的23個(gè)SNP(rs4731426、rs2167270、rs12405556、rs17

12、127107、rs10889502、rs7849191、rs9891119、rs4767860、rs2970847、rs6821591、 rs249429、rs3805486、rs1342382、rs6588640、rs6937、rs3766522、rs10783299、rs5017427、rs9648724、rs645163、rs6436094、rs6713532、rs16147)和ADIPO通路中14個(gè)基因(ADIPOQ、ADIPO

13、QR1、 ADIPOQR2、PPAR-alpha、PCK1,PCK2、G6PC,ACC2、 GLUT1、GLUT4、 CPT-1、RXRA、RXRB、RXRG)的25個(gè)SNP(rs266729、rs16861205、rs1342387、rs12733285、rs767870、rs1044471、rs4823613、rs5767743、 rs1042531、rs11908628、 rs2301336、 rs4982856、 rs25935

14、95、 rs2268388、rs3754219、rs12718444、rs5435、rs16956647、rs11228368、rs11185660、rs1045570、rs2744537、rs2076310、rs1467664、rs3753898)進(jìn)行分型。將核查后的問(wèn)卷信息、體格檢查及臨床生化檢查結(jié)果與SNP數(shù)據(jù)整合，用于統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)LEP通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果:
　　單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析中

15、，rs2167270在未調(diào)整協(xié)變量和調(diào)整協(xié)變量顯性模型下均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在未調(diào)整協(xié)變量和調(diào)整協(xié)變量共顯性模型下，基因型AG相對(duì)于基因型GG均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在未調(diào)整協(xié)變量超顯性模型下有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在調(diào)整協(xié)變量超顯性模型下無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;rs16147在穩(wěn)健檢驗(yàn)、隱形模型、超顯性模型下調(diào)整協(xié)變量前和調(diào)整協(xié)變量后均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，我們所檢測(cè)LEP基因的rs2167270和rs4731426、JAK1基因的rs10

16、889502和rs17127107、PPARGC1A基因的rs2970847和rs6821591、PRKAA1基因的rs249429和rs3805486、PRKAA2基因的rs1342382和rs6588640、PRKAB2基因的rs3766522和rs6937、PRKAG2基因的rs2970847和rs6821591、PRKAG3基因的rs6436094和rs645163等8個(gè)基因內(nèi)的各自2個(gè)位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡關(guān)系;非條件Logi

17、stic回歸分析未發(fā)現(xiàn)各基因內(nèi)LDblock的單倍型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性結(jié)果。
　　(2)ADIPO通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果:
　　無(wú)論是否加入?yún)f(xié)變量，ADIPO通路與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　(1)LEP通路中的rs2167270和rs16147與2型糖尿病存在關(guān)聯(lián);ADIPO通路中的rs3753898、rs1042531、rs12718444與2型糖尿病存在關(guān)聯(lián)。
　　(2)

18、ADIPO通路中RXRG基因內(nèi)rs1467664的等位基因T與rs3753898的等位基因A構(gòu)成的單倍型是2型糖尿病發(fā)生的高危因素。
　　(3)LEP通路與ADIPO通路兩條通路下基因中的SNP存在多對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的互作，SNP-SNP互作可以增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，是2型糖尿病遺傳結(jié)構(gòu)的組成部分。
　　(4)根據(jù)logistic kernel machine regression結(jié)果，尚不能認(rèn)為L(zhǎng)EP通路及ADIPO通路與