gp96多肽復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞對食管腺癌細(xì)胞的免疫殺傷作用

1、北 京 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) (醫(yī) 學(xué) 版 )J O U R N A LO FP E K I N GU N I V E R S I T Y ( H E A L T HS C I E N C E S )V o 1 ． 3 6N o ． 5O c t ． 2 0 0 4· 5 2 5·· 論 著 ·g p 9 6多肽復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞對 食管腺癌細(xì)胞的免疫殺傷作用 馬麗萍 ， 潘秀英 ， 李

2、娜， 劉玉京， 陳曉欣 ( 北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 1 0 0 0 4 4 )[ 關(guān)鍵詞]熱休克蛋白質(zhì) 9 0 ； 樹突細(xì)胞； 食管腫瘤 ； 免疫療法； 腺癌 [ 摘 要] 目的： 研究腫瘤細(xì)胞來源的 g p 9 6多肽復(fù)合物介導(dǎo)的對同～類型腫瘤 的免疫治療作用。方法： 提取純化 食管腺癌細(xì)胞系 S E G 一 1 裸鼠成瘤組織的 g p 9 6 蛋白多肽復(fù)合物， 與外周血單個(gè)核細(xì)胞( P B M N C ) 誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹

3、突狀 細(xì)胞( D C ) 結(jié)合， 制備 g p 9 6 ． D C疫苗； 臺盼藍(lán)拒染法測定淋巴細(xì)胞增殖率； E L I S A方法檢測細(xì)胞毒性 T淋 巴細(xì)胞 ( C T L ) 培養(yǎng)上清液的干擾素( I F N 一) 含量， M T Y 法檢測 C T L 對靶細(xì)胞 S E G 一 1 的殺傷率。結(jié)果： 5 5g 瘤組織提取純 化 g p 9 6 蛋白 1 2 0I ． t g ； 單獨(dú) D c 、 單獨(dú) g p 9 6 及 g p 9

4、 6 一 D C均能刺激淋巴細(xì)胞增殖， 產(chǎn)生 C T L ， 釋放 I F N 一， 對靶細(xì)胞 S E G 一1 均顯示一定的殺傷作用， 以 g p 9 6 一 D C的作用最明顯 ， 在效靶比4 0 ： 1 時(shí)， 殺傷率為 6 8 ％。單獨(dú) D C誘導(dǎo)的 C T L對 S E G 一 1 、 K 5 6 2的殺傷作用與非抗原刺激的淋巴細(xì)胞比較， 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性。結(jié)論： 腫瘤來源的熱休克蛋白g p 9 6可使 D C具有更強(qiáng)的刺激

5、T淋巴細(xì)胞增殖的能力， 所產(chǎn)生的 C T L對靶腫瘤細(xì)胞有明顯的特異殺傷作用。[ 中圖分類號]R 3 9 2 ． 1 2[ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[ 文章編號] 1 6 7 1 - 1 6 7 X ( 2 0 0 4 ) 0 5 - 0 5 2 5 - 0 4Th ek i l l i n ge f e c to fc y t o t o x i cTl y mh p o c y t e so ne s o p h a g e a la d

6、e n o c a r c i n o m ac e l l sm e -d i a t e db yg p 9 6 - p e p t i d ec o mp l e x e sM AL i — p i n g， P A NX i u — y i n g ， L IN a ， L I UY u - j i n g ， C H E NX i a o - x i n( C e n t r a lL a b o r a t o r y ，

7、P e k i n gU n i v e r s i t yP e o p l e ’ sH o s p i t a l ， B e i j i n g1 0 0 0 4 4 ， C h i n a )K E YW OR D SHe a t ． s h o c kp r o t e i n s9 0； De n d r i t i cc e l l s ； Es o p h a g e a ln e o p l a s ms ； I m

8、mu n o t h e r a p y； Ad e n o ．c a r c i n o maS U M M A R YO b j e c t i v e ： T os t u d yt h ei m m u n o t h e r a p e u t i ce f f e c to nt h ee s o p g a g e a la d e n o c a r c i n o m am e ．d i a t e db yg p 9

9、 6 ． p e p t i d ec o mp l e x e si s o l a t e df r o m t h es a mek i n do ft u mo r ．M e t h o d s ：g p 9 6 ．p e p t i d ec o m．p l e x e sw e r ep u r i f i e df r o mn u d em i c et u mo r sb u r d e n e db ys u b

10、c u t a n e o u si n j e c t i o no fh u m a ne s o p h a g e a la d ．e n o c a r c i n o mac e l ll i n eS E G 一 1．g o 9 6 ． p e p t i d ec o m p l e x e sw e r ec a r r i e db yt h ed e n d r i t i cc e l l s ( D C )i

11、n d u c e df r o m h u ma np e r ip h e r a l b l o o dmo n o n u c l e a rc e H st op r e p a r eg p 9 6 一 DCv a c c i n e ．T h ep r ol i f e r a t i o no fl y mp h o ．c y t e sw a st e s t e dw i t ht r y p a n ． b l

12、 u es t a i n ．T h eq u a n t i t yo fi n t e r f e r o n ．( I F N ．)r e l e a s e df r o mc y t o t o x i cTl ~ z n p h o c y t e s( C T L 1w a s d e t e c t e dw i t hE L I S Am e t h o d ．T h ek i l l i n ge f e c to

13、 fC T Lo nt a r g e tc e l lS E G ． 1w a s me a s u r e dw i t hMT T ．Re s u l t s ：W eo b t a i n e d1 2 0gg p 9 6f r o m 5 5gt u mo rt i s s u e ．DC，S O 9 6，a n dg p 9 6 ·D Ca l lc o u l de l i c i tt h ep r o l

14、i f e r a t i o no fl y mp h o c y t e sa n dma k et h e m b e c o mi n gi n t oC T Lwh i c hr e l e a se dI F N．a(chǎn) n ds h o we dd i f e r en td e g r e e so fk i l l i n ge f f e c to nt a rg e tc e l lS EG． 1 ．g p 9 6

15、． DCh a s t h es t r on g e s te l i c ．i t i n ge f f e c ta m o n gt h e m ． A tt h er a t i oo f E ( e f f e c t ) t oT ( t a r g e t ) a s 4 0 ： 1 ， t h ek i l l i n gr a t ew a s6 8 ％． N os i g ·n i f i c a n

16、td i f e r e n c eb e t we e nt hee f e c t so fC T Li n d u c e db yDCa l o n ea n do fl y mp h o c y t e swi t h o u ts p e c i f i ca nt i g e no nS E G ． 1a n dK 5 6 2c e l l s ．C o n c l u s i o n ：T h eg p 9 6 ． p

17、e p t i d ec o mp l e x e sf r o mt u m o r sc a ni mp r ov et h ee f e c to fe l i c i t i n gl y mp h o c y t ep r o l i f e r a t i o no fDCa n dma k et h el y mp h o c y t eb e c o mi n gi n t oC T Lmo r ee f -f e c

18、t i v e l y ． T h e s eCnJ ss h o wp r o mi n e n tk i l l i n ge f f e c to nt h et a rg e tt u mo rc e l s ．( JP e k i n gU n i vlH e a l t hS c iI ， 2 0 0 4 ． 3 6 ： 5 2 5— 5 2 8 )在腫瘤的免疫治療中， 大多數(shù)腫瘤還缺少特異 性抗原。近年發(fā)現(xiàn) ， 從腫瘤組織

19、 提取 的熱休克蛋 白( h e a ts h o c kp r o t e i n， H S P ) ， 帶有該腫瘤的抗原多肽 ，參與機(jī) 體 特異 的抗 腫 瘤 免疫 反 應(yīng) 。g p 9 6屬 于 H S t O 0家族 ， 是研究及應(yīng)用最多的熱休 克蛋白。本 文利用食管腺 癌細(xì)胞系 S E G ． 1 裸 鼠成瘤組織來 源 的 g p 9 6多肽復(fù)合物 的抗原性 ， 與樹突狀 細(xì)胞 ( d e n —d r i t i cc e

20、l l ， D C ) 結(jié)合 ， 制備 g p 9 6多肽復(fù)合物． D C疫 苗 ， 刺激產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性 T淋 巴細(xì)胞( C T L ) ， 觀 察 其對靶瘤細(xì)胞的殺傷作用 ， 探討g p 9 6 多肽復(fù)合物 基金項(xiàng) 目： 國家 自然科學(xué)基金( 3 0 1 7 1 0 5 0 ) 資助 S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n

21、 d a t i o no f C h i n a ( 3 0 1 7 1 0 5 0 )A C o r r e s p o n d i n ga u t ho re ma i l ， l i p i n g ma 2 0 0 0 @ y a h o o ． t o m． e l l維普資訊 http://www.cqvip.com 馬麗萍． 等6多肚復(fù)音物舟導(dǎo)的細(xì)睢毒性 r 淋細(xì)胞對食管隙將} f f 『 胞的免疫殺傷作用 2 )

22、， 可能與細(xì)胞密度過大 ， 細(xì)胞生長空間堿小有關(guān)。刺激強(qiáng)度以 g p 9 6 一 D C最強(qiáng) ， 明顯高于單獨(dú) D C ( P<0 ． O 1 ) ； 單獨(dú) g p 9 6 ( 1m g ／ L ) 的刺激作用介于二者之 間( 均 P< 0 ． O 1 ) 。三種條件刺激生長的淋巴細(xì)胞均 有 I F N 一釋放， 提 示被 誘導(dǎo)成 C T L ． 且作 用 仍 以g p 9 6 一 D C最強(qiáng)( 表 【 ) 。圈 1 從P

23、B M N C誘導(dǎo)培養(yǎng)H 1 的D cr i g u r e1D E shm P B MN C sw h i c h? c uJ l u ~ la n di n d u c e d40353 0252 015】 05018 0I ： 4 0】 ： 3 01 ： 2cJl ： l I Jl ： 5I ) C ： l ~ ' , 3 np h o c y l e+ P < 0 。 l +e o m p a , r e dw

24、i t hD Cg r o u p mD C ： L yFl ： l 0 ~ x l e d i —t l o n圈2 淋巴細(xì)胞分別經(jīng) D c羊 ¨ s t , 9 6 一 D C刺激后的增長曲線(，= 8 )F i g u r e2 “ P a e~ , 1 w ． a g i n go fl y m p h o c y t en u m b e ~ e h c i t e dh vD C一 1 rk ~ , 9 6 一 l

25、f．= 8 )表 l 不同刺激蕞件下 【 F N 1釋艟最比 較( D C ： L ? m p h ~y t e =l ： 1 0馬 l 【 g p 9 61L _ (±， 一 8JT a b l e1C 0 mo fI F N - 3 , q u ~ t l t ir e l e ~ di nd i f F e ~n te ~ n d i f i o n s( D C ： F ． y m p h o c ' c t

26、e = 1 ： 1 0o f 目【 叫 L ， t ±， n ： 8 )P< 00 5， c o m p a r e dw i t hD ca n d- D C：尸(0 ． 0 F ， 伽廿 卜p a r e dw i t hDC2 ． 5 特異性抗原刺激的 C T L對靶細(xì)胞有明顯殺傷 作用單獨(dú) D c 、 單獨(dú) g p 9 6 或 g p 9 6 一 D C刺激產(chǎn)生的效 應(yīng)淋巴細(xì)胞即 C T L作用于靶細(xì)胞 S E

27、 G ． 1 ， 在效靶 比1 0 ： I ～ 4 0 ： 1 的范 圍內(nèi)， 均顯示殺傷作用 ， 且隨救靶 比的增加而增加 ， 以 g p 9 6 一 D C作用最強(qiáng)， 單獨(dú) D c 最 弱． ． 在效靶比4 0 ： l 時(shí)， g p 9 6 一 D C 、 單獨(dú) g p 9 6或單獨(dú) D C的殺傷率分別為 6 8 ％ 、 3 9 ％、 2 6 ％。不但細(xì)胞數(shù) 量減少 ． 細(xì)胞形態(tài)也有改變， 細(xì)胞皺縮 ， 有空泡形成 ( 圖 3 ) ．

28、 = 未經(jīng)抗原刺激的淋巴細(xì)胞對 S E G — l 也有殺 傷作用， 但效率低， 在效靶比1 0 ： 1 ～ 4 0 ： 1 問， 殺傷率 為2 2 ％ ～ 2 5 ％。淋巴細(xì)胞在單獨(dú) D C刺激和無任何 抗原刺激的情況下對 S E G 一 1 的殺傷作用無差異； 單 獨(dú) g p 9 6與 g p 9 6 一 D C之間效果 比較以及單獨(dú) G P 9 6與單獨(dú) D C之間比較， 差異均有顯著性 ( P< 0 ． O l ， 圖 4

29、 j 單獨(dú) D C 、 單獨(dú) g p 9 6或 g p 9 6 - D C刺激 產(chǎn)生的 C T I對非相關(guān)腫瘤細(xì)胞 K 5 6 2 也顯示一定的殺傷作 用 ， 但各組殺傷效率差異無顯著性， 在效靶 比 4 0 ： 1條件下． 殺傷率為 2 3 ％ ～ 2 5 ％。， S E C ~1w i t h o utI F P a [ n l e H I ： B． S E G1t r e a t e d[ hC T L圖 3C T L 作用前后

30、S E G ． 1 彤態(tài)變化 F l g t t r e3T h ec · h 曲 R 雌 o fc e l lm o r p ho l o g yt nS E G- It r e a t e dw l 山 C T L囝K5 6 2S E 0 1I ' u m o rc e l I sT hk i l l i n gt - d i e ． o fS E G - la n dK 5 6 2w i l h m t lt r

31、 e a l m~ ttl 00P ( 0 ． 0 le o m [ ~ dw i t h s 1 , 9 6o rD C圖 4C T L對腫精細(xì)胞 的殺傷率( E f e c t ： T a r g e t=4 0 ： 1 ^ = 8 )F i g u r e4K i l l i n ~mIo f C T Lo nI Ⅱ ∞ U s( E f e c t ： T a ~ e s=4 0 ： - ．， n ： 8J帥∞ 蚰 蛐 Ⅺ