超順磁性氧化鐵納米顆粒標記系統(tǒng)體內(nèi)示蹤內(nèi)皮祖細胞移植對血管內(nèi)皮損傷的修復作用.pdf

1、血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化、血管再狹窄等心血管疾病的始動因素。其病理基礎是血管內(nèi)皮細胞損傷，內(nèi)膜下基質(zhì)暴露，血小板黏附聚集于該處，脫顆粒釋放出有絲分裂原，后者在趨化血小板和粒細胞聚集的同時，又刺激中膜平滑肌細胞增殖、遷移、分泌以及血管壁結(jié)構(gòu)的重塑。同時，血管內(nèi)皮完整性的破壞也會導致其自身分泌的血管保護性介質(zhì)(一氧化氮、前列環(huán)素等)的減少，血管收縮性介質(zhì)及促生長物質(zhì)的分泌增多。研究表明血管損傷后早期管腔內(nèi)的再上皮化速度是決定修復后局部內(nèi)膜

2、增生程度的重要因素。如何加快損傷血管腔內(nèi)面的上皮化從而有效修復內(nèi)皮并抑制平滑肌增生已成為研究熱點之一。
　　內(nèi)皮祖細胞是一類來源于骨髓，動員后可進入外周血循環(huán)，定向歸巢至損傷部位并進行分化的祖細胞群。大量研究己表明內(nèi)皮祖細胞在血管新生和內(nèi)膜修復中的重要作用。但在體外如何獲取足量的內(nèi)皮祖細胞，同時保證細胞的活性及生物學特征，避免其出現(xiàn)分化異常等仍是學者們需要解決的問題。另外了解內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)的生物學分布、分化增殖等細胞的定位反饋情況

3、可優(yōu)化移植細胞的途徑和細胞移植治療的時間，從而指導臨床的進一步治療。
　　磁共振成像(MRI)具有特異性和敏感性高，空間分辨力強及臨床安全等優(yōu)勢得以迅速發(fā)展，同時磁性物質(zhì)標記細胞后并不會對細胞產(chǎn)生顯著的生物學影響，且不需要放射性同位素(利于縱向長期研究)，因而廣泛用于體內(nèi)示蹤干細胞的影像學檢查。本研究利用磁性物質(zhì)標記細胞，從而體外示蹤移植細胞的生物學分布。首先我們體外分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，并在一定的條件下誘導其分化成為內(nèi)皮祖細胞

4、并擴增，隨后通過超順磁性氧化鐵顆粒標記細胞，并將標記后的細胞移植入實驗動脈頸動脈損傷模型，從而動態(tài)示蹤細胞并評估內(nèi)皮祖細胞在內(nèi)皮修復過程中的作用。
　　第一部分骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定及擴增兔骨髓源性間充質(zhì)干細胞誘導分化后的內(nèi)皮祖細胞。方法：密度梯度離心法結(jié)合貼壁法從骨髓中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞(MSCs)。以VEGF、bFGF定向誘導間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮祖細胞。對誘導后的細胞進行

5、流式細胞、免疫熒光及免疫組織化學鑒定。結(jié)果：誘導后24h圓形細胞貼壁；72h細胞集落形成，呈紡錘形放射狀生長：5d細胞呈漩渦狀或條索狀生長；7d內(nèi)皮樣細胞成片生長，互相連接并具有管腔樣結(jié)構(gòu)。流式細胞儀檢測提示CD34、CD133雙陽細胞占2.16±0.09％；免疫組化提示KDR陽性細胞占72.5±8.76％。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示細胞Dil-ac-LDI，和FITC-UEA-1呈雙染陽性。結(jié)論：密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離出的骨髓間

6、充質(zhì)干細胞，通過體外誘導分化可培養(yǎng)成為內(nèi)皮祖細胞。
　　第二部分體外超順磁性氧化鐵納米顆粒及綠色熒光蛋白病毒顆粒標記內(nèi)皮祖細胞的生物學研究
　　目的：評估超順磁性納米鐵顆粒及綠色熒光蛋白慢病毒顆粒標記對內(nèi)皮祖細胞的毒性及細胞活力影響。方法：分別采用不同濃度的納米鐵顆粒轉(zhuǎn)染和不同感染復數(shù)的慢病毒顆粒感染內(nèi)皮祖細胞，評估細胞的MRI信號強度及細胞的活力試驗、增殖試驗、LDH釋放試驗、遷移試驗及對細胞周期和凋亡試驗。結(jié)果：隨著納米

7、鐵濃度的增加，T2WI MRI信號強度逐漸降低，在50ug/ml和100ug/ml難以分辨；細胞活力試驗提示隨著鐵濃度的增加，細胞活力逐漸減低；LDH釋放率逐漸增加，但<10％；對增殖能力、遷移能力及細胞周期和細胞凋亡均無影響。隨著感染復數(shù)(MOI)的增加，細胞活力明顯下降，MOI=50，細胞活力差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MOI=50，LDH釋放率為10.34％，對細胞有一定毒性；MOI=25和50，細胞凋亡增加差異有統(tǒng)計學意義

8、(P<0.05)，且遷移能力受到影響(P<0.05);不同MOI對增殖能力影響差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論：Fe2+濃度在25ug/ml，MOI=10的條件下，超順磁性氧化鐵顆粒對內(nèi)皮祖細胞的生物學特性沒有影響，可以作為磁標記。
　　第三部分體內(nèi)磁共振成像示蹤超順磁性氧化鐵納米顆粒標記的內(nèi)皮祖細胞修復內(nèi)膜損傷的實驗研究
　　目的：評價MRI示蹤SPIO標記的內(nèi)皮祖細胞移植促損傷動脈內(nèi)皮修復的作用。方法：將菲立磁和綠色熒光蛋白雙標記