苦參堿誘導(dǎo)的自噬在原發(fā)性肝癌中的作用.pdf

1、背景：
　　 苦參堿是中藥苦參中提取的主要有效活性物質(zhì)，研究顯示它具有一定的抗腫瘤作用，然而其具體的機(jī)制不清。
　　 目的：
　　 探討苦參堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞和肝卵圓細(xì)胞的自噬現(xiàn)象及分子機(jī)制。
　　 第一部分：
　　 苦參堿誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞的自噬現(xiàn)象及機(jī)制研究
　　 材料和方法：
　　 不同濃度苦參堿作用于大鼠肝卵圓細(xì)胞系WB-F344，構(gòu)建體外模型。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；應(yīng)用M

2、DC染色熒光定位法、LC3Ⅱ/Ⅰ免疫印跡法(Westem blotting)和電鏡法檢測(cè)細(xì)胞的自噬；應(yīng)用PCR和免疫印跡法探討苦參堿誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1．0.4mg/ml和0.8mg/ml苦參堿作用于肝卵圓細(xì)胞WB-F344后，MDC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和自噬特異標(biāo)記分子LC3Ⅱ水平顯著增加，說(shuō)明一定濃度的苦參堿誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞自噬產(chǎn)生，電鏡進(jìn)一步確證自噬體的誘導(dǎo)。2．0.4mg/ml和0.8mg/ml苦參堿

3、顯著誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，呈濃度依賴(lài)性，RT-PCR觀察到0.4mg/ml和0.8mg/ml苦參堿作用后，凋亡標(biāo)記分子BCL-2 mRNA水平下降，BAX mRNA水平增加，從而導(dǎo)致BCL-2/BAX mRNA比例顯著下降，說(shuō)明一定濃度的苦參堿能同時(shí)誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，與BCL-2、BAX分子表達(dá)變化相關(guān)。3．0.8mg/ml苦參堿聯(lián)合自噬特異抑制劑3-MA（3-methyladenine，三甲基腺嘌呤）后，細(xì)胞凋亡顯著增加。4．與

4、對(duì)照細(xì)胞相比，0.8mg/ml苦參堿作用于肝卵圓細(xì)胞后，β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著下降；過(guò)表達(dá)和特異激動(dòng)劑異常激活β-catenin蛋白導(dǎo)致自噬特異標(biāo)記分子LC3Ⅱ水平和凋亡標(biāo)記分子BCL-2/BAX mRNA比例顯著升高；然而RNA干擾技術(shù)(RNAi)特異抑制β-catenin蛋白后，LC3Ⅱ水平和BCL-2/BAX mRNA比例降低，提示β-catenin蛋白參與苦參堿誘導(dǎo)的自噬和凋亡；5．自噬特異激動(dòng)劑Rapamycin誘

5、導(dǎo)β-catenin蛋白表達(dá)下降，而苦參堿聯(lián)合自噬特異抑制劑3-MA后，下降的β-catenin蛋白水平反而增加，提示自噬體參與β-catenin蛋白水平的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論：
　　 一定濃度苦參堿可誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞自噬和凋亡增加，而抑制自噬后細(xì)胞凋亡顯著增加。β-catenin蛋白參與苦參堿誘導(dǎo)的自噬與凋亡，而自噬增加時(shí)反饋抑制β-catenin蛋白，β-catenin分子可能是自噬和凋亡相互轉(zhuǎn)變的橋梁。
　　

6、第二部分：
　　 苦參堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的自噬現(xiàn)象及機(jī)制研究
　　 材料和方法：
　　 不同濃度苦參堿作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721，構(gòu)建體外模型。應(yīng)用MDC染色法、GFP-LC3熒光定位法、LC3Ⅱ/Ⅰ免疫印跡法和電鏡法檢測(cè)細(xì)胞的自噬；應(yīng)用基因芯片和免疫印跡法探討苦參堿誘導(dǎo)自噬的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1．不同濃度苦參堿作用于HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

7、和凋亡的產(chǎn)生，抑制自噬可使細(xì)胞凋亡顯著增加。2．在HepG2細(xì)胞系中，自噬呈非mTOR依賴(lài)的途徑，而在SMMC-7721細(xì)胞系中，自噬呈mTOR依賴(lài)的途徑。3．苦參堿作用于HepG2細(xì)胞系中，我們觀察到苦參堿誘導(dǎo)的自噬涉及p53/AMPK信號(hào)通路，而抑制AMPK活性，細(xì)胞凋亡顯著增加。4．我們發(fā)現(xiàn)p53異構(gòu)體(p53β、p53γ、△133p53和△133p53γ)與苦參堿誘導(dǎo)的自噬相關(guān)。5．利用基因芯片探討苦參堿的分子機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)干擾