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文檔簡介
1、目的:近年來研究表明,PI3K/AKT能經過多種途徑抑制細胞凋亡,促進細胞存活。凋亡抑制蛋白家族通過抑制細胞凋亡從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前,國內外尚未見關于PI3K/AKT和腫瘤凋亡抑制蛋白XIAP、cIAP2三者在卵巢癌中調控機制的研究。本實驗通過對轉染PEGFP-N3-AKT2入經紫外線照射10分鐘的卵巢癌細胞NIH:OVCAR-3中,檢測各組AKT2、XIAP、cIAP2的mRNA及蛋白表達情況以及檢測各組細胞早期凋亡率和增殖率
2、。從而探討PI3K/AKT與XIAP、cIAP2之間的關系。為卵巢癌基因治療提供新的策略。
方法:研究對象為人卵巢癌NIH:OVCAR-3細胞株。(1)構建針對PEGFP-N3-AKT2質粒。(2)用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH:OVCAR-3細胞。(3)通過脂質體轉染進入均接受紫外線照射10分鐘的卵巢癌細胞,并設置空白對照組(Blank)、空質粒組(陰性對照組)、AKT組(實驗組)。(4)Annexin-FITC流式細胞術檢
3、測轉染48h后各組卵巢癌細胞NIH:OVCAR-3的凋亡率。(5)MTT法檢測轉染48h后各組卵巢癌細胞NIH:OVCAR-3的增殖率。(6)RT-PCR檢測轉染48h后各組細胞AKT2 mRNA、XIAP mRNA及cIAP2 mRNA表達情況。(7)Western Blot檢測轉染48h后各組細胞AKT2、XIAP及cIAP2蛋白表達情況。
結果:(1)AnnexinV-FITC流式細胞術檢測卵巢癌細胞NIH:OVCA
4、R-3早期凋亡結果顯示:空白組、空質粒組、AKT組的凋亡率分別是15.6%、16.53%、5.27%。AKT組凋亡率低于空白對照組組及空質粒組,有統(tǒng)計學意義(P<0.05),空白對照組及空質粒組之間無明顯變化(P>0.05)。(2)MTT法檢測卵巢癌細胞NIH:OVCAR-3的增殖率:空白對照組、空質粒組及AKT組細胞增殖率分別為100%、91.3%、197%,AKT組的OD值比其他兩組高,細胞的增值率明顯增加,有統(tǒng)計學意義(P<0.0
5、5),空白對照組與空質粒對照組細胞增值率比較無明顯變化(P>0.05)。(3)RT-PCR檢測轉染48h后各組細胞中AKT2、XIAP及cIAP2基因mRNA的表達結果顯示:AKT2 mRNA相對表達含量空白組為28.0±10.0、空質粒組為23.8±5.4、AKT組為482.1±291.3,AKT組比空白組及空質粒組的mRNA相對表達含量高,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而空白組與空質粒組的相對表達含量比較,無統(tǒng)計學意義(P>0
6、.05);XIAP mRNA相對表達含量空白組為88.1±30.2、空質粒組為84.9±37.3、AKT組為248.6±38.6,AKT組比空白組及空質粒組相對表達含量高,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而空白組與空質粒組的相對表達含量比較,無統(tǒng)計學意義(P>0.05);cIAP2 mRNA相對表達含量空白組為42.4±12.6、空質粒組為39.0±4.5、AKT組為270.7±65.9,AKT組比空白組及空質粒組相對表達含量高,其
7、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而空白組與空質粒組的相對表達含量比較,無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(4)Western blot檢測轉染48小時后各組細胞中AKT2、XIAP及cIAP2基因蛋白表達結果顯示,AKT蛋白表達含量空白組為39.85±0.3、空質粒組為50.5±2.2、AKT組為105.5±2.6;XIAP蛋白表達含量空白組為35.05±0.4、空質粒組為40.5±1.2、AKT組為73.1±1.5;cIAP2蛋白表達含
8、量空白組為10.1±0.1、空質粒組為11.8±0.6、AKT組為29.6±0.2。AKT組的各個蛋白含量都較空白組及空質粒組的含量高,有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而空白對照組和空質粒組各個蛋白含量比較,沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
結論:本實驗中,PEGFP-N3-AKT2質粒的轉染可抑制經紫外線照射的卵巢癌細胞NIH:OVCAR-3的凋亡,同時轉染AKT,上調AKT后,可使凋亡抑制蛋白XIAP mRNA、cIAP
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