肝臟淤血再灌注損傷及其保護(hù)措施的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分肝臟淤血再灌注損傷的機(jī)制研究
　　引言：
　　肝移植是拯救終末期肝病的唯一有效手段。隨著肝移植需求的逐年增加，供肝短缺的現(xiàn)狀也日趨明顯，嚴(yán)重制約其發(fā)展。活體肝移植技術(shù)成為解決供肝匱乏難題的有效方法，拓展了肝移植的適應(yīng)證，技術(shù)上日臻完美，并獲得與全肝移植媲美的療效。包含中肝靜脈的右半供肝在為成人受體提供更多有功能肝實(shí)質(zhì)的同時也增加了供體肝衰的風(fēng)險。不包含中肝靜脈的右半供肝雖能很好地平衡分配供受體的肝體積，但其主要桎梏為

2、右肝前葉潛在的靜脈回流障礙導(dǎo)致的肝臟淤血。為了確保供體安全，多數(shù)中心提出改良右半肝活體肝移植的術(shù)式，即選擇不含中肝靜脈的右半供肝，采用血管移植物來重建中肝靜脈的屬支。這種方法在供肝獲取和植入過程中，必須阻斷右肝前葉匯入中肝靜脈的分支，雖然重建流出道，但難以避免右肝前葉長時間的淤血，造成一種特殊類型的移植肝損傷——淤血再灌注損傷，導(dǎo)致肝竇淤血、肝細(xì)胞壞死和微循環(huán)障礙，使得移植肝有效體積減少，對于術(shù)前一般情況較差的受體，可能直接導(dǎo)致小肝綜合

3、征，嚴(yán)重影響預(yù)后。在肝移植手術(shù)過程中，呼氣末正壓和中心靜脈壓過高會引起肝靜脈回流障礙，肝竇內(nèi)血流淤滯，造成明顯的肝臟淤血情況。在肝膽外科急診肝破裂手術(shù)中經(jīng)常難以避免損傷肝靜脈，以及復(fù)雜肝臟切除手術(shù)中醫(yī)源性意外縫扎肝靜脈導(dǎo)致的肝臟淤血。肝臟淤血再灌注損傷將導(dǎo)致肝臟組織細(xì)胞發(fā)生一系列代謝、結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，直接影響移植術(shù)后肝功能的恢復(fù)、手術(shù)成功率和患者生存率。
　　現(xiàn)今，在移植領(lǐng)域?qū)τ诟闻K缺血再灌注損傷的機(jī)制已進(jìn)行了深入地研究，建立了

4、熱缺血和冷缺血模型，但仍缺乏對肝靜脈回流障礙引起的肝臟淤血再灌注損傷內(nèi)在機(jī)制的研究。本研究目的在于闡明肝臟淤血再灌注損傷中肝細(xì)胞損傷和微循環(huán)障礙的病理生理過程，為下一步尋找有效干預(yù)措施提供理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　(1)動物分組:
　　清潔級選用近交系C57BL/6(H2b)小鼠。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組（假手術(shù)SO、缺血再灌注IR和淤血再灌注CR），術(shù)后2、6和24小時每個時點(diǎn)各6只小鼠。
　　IR模型:

5、
　　無損傷血管鉗阻斷左肝前葉（LAHL）的門靜脈和肝動脈入肝血流，75分鐘后開放血流;
　　CR模型:
　　(1)10-0線縫扎LAHL的回流靜脈，75分鐘后松解縫線開放血流。阻斷之前需全身肝素化（2U/g）。
　　(2)肝功能檢測:
　　血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用全自動生化分析儀測定。
　　(3)肝組織髓過氧化物酶(MPO)活性檢測:
　　按南京建成生物工程研究所提供

6、的試劑盒說明書操作。
　　(4)組織學(xué):
　　肝臟組織經(jīng)福爾馬林固定后，行石蠟包埋、切片，HE染色，行光鏡組織學(xué)觀察肝細(xì)胞腫脹、空泡變性、細(xì)胞破壞、核溶解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，判斷肝組織壞死程度。
　　(5) TUNEL法測凋亡:
　　利用商品化試劑盒行TUNEL染色，比較各組在平均每個高倍視野的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，判定肝細(xì)胞的凋亡程度。
　　(6)肝臟微循環(huán):
　　在體熒光顯微鏡檢測。異硫氰酸酯熒光標(biāo)記

7、的右旋糖酐標(biāo)注紅細(xì)胞檢測微血管灌注率。羅丹明-6G標(biāo)記白細(xì)胞定量分析白細(xì)胞在肝竇和竇后靜脈內(nèi)的流動變化。選取以下指標(biāo):①肝竇未灌注率:血流未灌注肝竇/肝竇總數(shù)×100％。②粘附白細(xì)胞:粘附于肝竇和竇后靜脈內(nèi)皮，靜止30秒及以上者。隨機(jī)選取10個高倍鏡視野計(jì)數(shù)平均每個高倍鏡視野粘附于肝竇上的白細(xì)胞數(shù)量。③滾動白細(xì)胞:靜止30秒以內(nèi)者，隨機(jī)選取與肝竇相連的10個竇后靜脈，分別計(jì)算每分鐘和每毫米靜脈壁上滾動白細(xì)胞的數(shù)量。
　　(7) r

8、eal-time PCR測炎癥因子:
　　選取50-100mg肝組織，采用Trizol試劑金提取總RNA，測定RNA260/280 nm的吸光度，判定其完整性和純度。按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書將3μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取cDNA加入ABI PRISM7500 Real-Time PCR擴(kuò)增儀，SYBR Green用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)。用目的基因與β-actin的比值表示目的基因的相對表達(dá)水平。
　　(8)統(tǒng)計(jì)方法:
　　數(shù)

9、據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。以P＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　(1)肉眼觀
　　IR組阻斷LAHL的入肝血流后，肝葉顏色變白，去除阻斷鉗后，顏色恢復(fù)紅潤。CR組阻斷LAHL的回流靜脈后，LAHL顏色進(jìn)行性變暗，60秒內(nèi)肝葉變得腫脹，與臨床的肝淤血十分相似，松解結(jié)扎線后，肝葉的顏色逐漸恢復(fù)紅潤，肝葉表面留有散在的淤血灶，再灌注2小時后淤血灶逐漸消褪。再灌注6小時和24

10、小時后，LAHL和正常肝葉無明顯差別。
　　(2)肝功能
　　IR組和CR組再灌注后ALT和AST均明顯增高，2小時達(dá)到高峰，到24小時開始減退。與IR組相比，CR組的ALT和AST在再灌注后2小時表達(dá)顯著增高(ALT:884.2±200.5 vs.459.7±149.1 U/L, AST:792.5±93.5 vs.520.8±124.2 U/L,P＜0.05)，再灌注后6小時仍增高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ALT:604.0±18

11、7.4 vs.498.8±199.9，AST:703.5±.162.6 vs.584.2±204.9，P＞0.05)，到24小時兩者水平相當(dāng)。
　　(3) MPO
　　CR組和IR組的MPO活性在再灌注后2小時迅速增高，隨著再灌注時間延長而減少。 CR組在再灌注后24小時，MPO表達(dá)顯著高于IR組(0.34±0.11 U/g vs.0.15±0.04 U/g, P＜0.01)。
　　(4)組織學(xué)和TUNEL
　　

12、肝臟HE染色顯示IR組表現(xiàn)為空泡變性、中度肝細(xì)胞壞死及中性粒細(xì)胞侵潤;CR組表現(xiàn)為更明顯的中度肝細(xì)胞空泡變性、壞死并伴有局部肝竇淤血。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)SO組極少見凋亡細(xì)胞（0.3±0.2陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野），IR組和CR組再灌注后2小時凋亡細(xì)胞顯著增多，但兩組凋亡程度相似（2.7±0.6 vs.2.8±0.9陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野，P＞0.05）。
　　(5)肝臟微循環(huán)
　　①肝竇未灌注率:
　　在體熒光顯微鏡顯示I

13、R組和CR組肝臟微循環(huán)灌注障礙，與SO組肝竇未灌注率(2.5±0.85％)相比，IR組和CR組的肝竇未灌注率明顯升高，其中再灌注后2小時，CR組明顯高于IR組(27.4±1.97％ vs.23.8±1.93％，P＜0.05)。CR組在中央肝竇的血流灌注明顯低于周圍肝竇。
　?、谡掣桨准?xì)胞和滾動白細(xì)胞:
　　CR組內(nèi)皮細(xì)胞同白細(xì)胞的相互作用增強(qiáng)，促進(jìn)白細(xì)胞的激活和粘附。再灌注后各時間點(diǎn)，CR組竇后靜脈內(nèi)的滾動白細(xì)胞和粘附白細(xì)胞

14、數(shù)量明顯增加，CR和IR兩組間在肝臟微循環(huán)白細(xì)胞數(shù)量上無明顯差異。
　　(6)細(xì)胞因子
　　與SO組相比，CR組和IR組再灌注后2、6和24小時， IL-1β、MCP-1、IL-6和TNF-α均顯著增高。CR組和IR組相比，TNF-α和IL-6無明顯差異，而IL-1β在再灌注后6小時，MCP-1在再灌注后2、6小時顯著增高。
　　結(jié)論：
　　肝臟淤血再灌注損傷引起肝細(xì)胞損傷和微循環(huán)障礙的嚴(yán)重程度高于缺血再灌注損傷

15、，其發(fā)生與肝竇內(nèi)壓增高、血液返流，直接損傷肝竇內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致功能紊亂;肝竇內(nèi)血栓或微血栓形成;肝竇灌注率下降，竇內(nèi)白細(xì)胞堆積并激活，釋放大量炎癥因子相關(guān)。
　　第二部分肝臟淤血再灌注損傷保護(hù)措施的機(jī)制研究
　　引言：
　　活體肝移植作為一種解決供肝匱乏難題的有效方法，技術(shù)上日臻完美，并獲得可與全肝移植媲美的療效。但由于肝臟靜脈系統(tǒng)的獨(dú)特性，活體肝移植技術(shù)上難以避免中肝靜脈回流障礙，致部分肝葉淤血的弊端，致使有效肝實(shí)質(zhì)減少

16、，嚴(yán)重者發(fā)生小肝綜合征，直接導(dǎo)致移植失敗。多數(shù)中心采用血管架橋作重建淤血肝段流出道，這就勢必造成肝臟淤血再灌注損傷(CRI)。我們在小鼠肝臟CRI模型上發(fā)現(xiàn)CRI導(dǎo)致的肝臟微循環(huán)障礙和肝細(xì)胞破壞程度遠(yuǎn)高于缺血再灌注損傷(IRI)，其發(fā)生與肝竇內(nèi)壓增高、血液返流，直接損傷肝竇內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致功能紊亂;肝竇內(nèi)血栓或微血栓形成;肝竇灌注率下降，竇內(nèi)白細(xì)胞堆積并激活，釋放大量炎癥因子相關(guān)。盡管治療肝臟IRI的各種手段和藥物已在實(shí)驗(yàn)和臨床中進(jìn)行廣泛的

17、研究和應(yīng)用，但目前仍缺乏對CRI保護(hù)措施的研究。
　　大量臨床和動物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)缺血預(yù)處理(IPC)對肝臟IRI具有保護(hù)作用。在IRI模型上，IPC可能通過改變細(xì)胞能量代謝、減輕炎性細(xì)胞浸潤、促進(jìn)肝臟再生和調(diào)節(jié)促炎因子等發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚未明確。HO-1具有抗氧化、抗炎、維持微循環(huán)，從而保護(hù)肝細(xì)胞的作用。HO-1的表達(dá)依賴于轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激活，Nrf2為細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。在生理狀態(tài)下Keap1與Nrf2結(jié)合使

18、其活性處于相對靜默狀態(tài)。在氧化應(yīng)激源的作用下，Nrf2和Keap1解除偶聯(lián)后入核與ARE結(jié)合，啟動ARE調(diào)控的抗氧化基因HO-1的表達(dá)。因此，Nrf2/HO-1信號通路是重要的抗氧化、保護(hù)細(xì)胞的途徑。本研究假設(shè)IPC作用于肝內(nèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路，從而起到減輕CRI的作用。
　　材料和方法：
　　(1)動物模型及分組:
　　清潔級選用近交系C57BL/6(H2b)小鼠。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為3組:假手

19、術(shù)（Sham組）、淤血再灌注損傷（CRI組）、缺血預(yù)處理+淤血再灌注（IPC+CRI組）和淤血預(yù)處理+淤血再灌注（CPC+CRI組）。再灌注后2、6、24、48小時和7天取標(biāo)本，每個時間點(diǎn)各6只小鼠。CRI組:10-0線縫扎左肝前葉（LAHL）的肝靜脈，完全阻斷LAHL回血，75min后松解縫線開放血流;IPC+CRI組:預(yù)先阻斷LAHL的入肝血流10min，再開放血流灌注10min后制造CRI。CPC+CRI:預(yù)先阻斷LAHL回流靜脈

20、造成淤血10min，再開放血流灌注10min后制造CRI。阻斷之前小鼠需全身肝素化（2U/g）。
　　(2)肝功能檢測:
　　血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用全自動生化分析儀測定。
　　(3)肝組織髓過氧化物酶(MPO)活性檢測:
　　按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書操作。
　　(4)組織學(xué):
　　肝臟組織經(jīng)福爾馬林固定后，行石蠟包埋、切片，HE染色，行光鏡組織學(xué)觀察肝細(xì)胞

21、腫脹、空泡變性、細(xì)胞破壞、核溶解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，判斷肝組織壞死程度。
　　(5) TUNEL法測凋亡:
　　利用商品化試劑盒行TUNEL染色，比較各組在平均每個高倍視野的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，判定肝細(xì)胞的凋亡程度。
　　(6) real-time PCR測炎癥因子:
　　選取50-100mg肝組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，測定RNA260/280 nm的吸光度，判定其完整性和純度。按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書將3

22、μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取cDNA加入ABI PRISM7500 Real-Time PCR擴(kuò)增儀，SYBR Green用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)。用目的基因與β-actin的比值表示目的基因的相對表達(dá)水平。
　　(7)統(tǒng)計(jì)方法:
　　數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。以P＜0.05為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　(1)肝功能
　　與CRI組相比，IPC-CRI組ALT的

23、表達(dá)在2、6小時明顯改善，2小時(839.2±132.5 vs.384.2±94.8, P＜0.01),6小時(680±142.4 vs.342.3±99.7, P＜0.01),到24小時以后兩者水平無明顯差異。然而，與CRI組相比，CPC-CRI術(shù)后肝功能損傷加重，ALT表達(dá)增高:2小時(839.2±132.5 vs.1087.5±192.5，P＜0.05)，6小時(680±142.4 vs.626.7±140.9，P＞0.05)，表

24、明CPC與IPC不同，對CRI無治療效果。
　　(2)組織學(xué)和TUNEL
　　CRI組HE染色顯示超過30％～60％的肝臟細(xì)胞發(fā)生空泡樣變性，肝竇輕微擴(kuò)張，肝實(shí)質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯。與CRI相比，IPC-CRI組肝臟淤血性損傷明顯減輕，不足30％的肝臟細(xì)胞發(fā)生空泡樣變性，肝竇擴(kuò)張不明顯，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，Suzuki評分較CRI組明顯下降(2小時:3.2±0.4 vs.1.8±0.4;6小時:3.2±0.3 vs.1.

25、7±0.5，P＜0.05)。另一方面，CPC-CRI組表現(xiàn)為更嚴(yán)重的肝臟淤血和壞死，Suzuki評分與CRI組相當(dāng)(2小時:3.2±0.4 vs.3±1.1，P＞0.05;6小時:3.2±0.3vs.3.5±0.5，P＞0.05)。表明CPC對CRI沒有治愈效果，反而加重CRI對肝竇的破壞。
　　TUNEL染色顯示CRI組大量凋亡肝細(xì)胞，IPC-CRI組肝細(xì)胞凋亡明顯減輕(2小時:22.0±13.8 vs.6.1±1.4，P＜0.

26、05;6小時:10.7±6.0 vs.4.5±1.1，P＜0.05;24小時:12.1±8.5 vs.4.3±2.7，P＜0.05;陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野）。
　　(3) MPO
　　CRI組的MPO活性在再灌注后2小時迅速升高，隨著再灌注時間的延長而下降。IPC-CRI組在再灌注后2、6小時，MPO表達(dá)低于CRI組（2小時:7.1±4.0 U/g vs.3.8±1.6U/g，P＜0.05;6小時:8.1±1.3 U/g vs

27、.5.2±3.0 U/g，P＜0.05），表明IPC能有效減輕中性粒細(xì)胞的侵潤。再灌注后24小時兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(4)炎癥因子
　　Real-time PCR測定炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1和IFN-γ）。與CRI組相比，IPC-CRI組IL-1、IL-6、TNF-α和MCP-1表達(dá)在再灌注后24小時均顯著下降;其中IL-1和IL-6在再灌注后2、6小時顯著下降;兩組間IFN-γ的表達(dá)無顯著