缺血后處理對肝臟缺血—再灌注損傷的保護(hù)作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的
　　 肝臟缺血.再灌注損傷(ischemia reperfusion injure,IRI)是肝外傷、肝移植以及機體遭受重度創(chuàng)傷、燒傷、休克等臨床常見的病理生理現(xiàn)象,也是許多肝缺血性疾病預(yù)后不良的重要原因。肝缺血再灌注可引發(fā)肝組織細(xì)胞出現(xiàn)壞死、凋亡等不可逆損害,甚至導(dǎo)致肝功能衰竭。因此,深入研究肝臟缺血.再灌注損傷的病理生理機制及尋找各種抗肝缺血.再灌注損傷策略一直是肝臟研究領(lǐng)域的重要方向。作為一種啟動機體內(nèi)源性保護(hù)機制的

2、方法,缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IpreC)對肝臟缺血一再灌注的保護(hù)作用已得到普遍的認(rèn)可。然而,由于IpreC必須在器官長久缺血前實施,這在一定程度上限制了其在臨床的推廣。最近,一種新的干預(yù)策略-缺血后處理(ischemic postconditioning,IpostC)因其能減輕心臟缺血-再灌注損傷而引起了廣泛的關(guān)注。IpostC是指通過在再灌注起始時,實施數(shù)個循環(huán)的短暫的血流灌注(on)/阻斷(

3、off),能夠減輕隨后再灌注引起的損傷。IpostC實施方法與IpreC相似,但其具有簡便易行、實施時機合理等優(yōu)點,因而在臨床應(yīng)用方面具有誘人的應(yīng)用前景。但是,目前大多數(shù)IpostC研究多集中在心臟方面,對其他臟器缺血.再灌注損傷是否具有保護(hù)作用尚不確定,因此本研究首先探討了不同方式的IpostC對小鼠肝臟缺血.再灌注損傷是否具有保護(hù)作用,并與IpreC和聯(lián)合應(yīng)用IpreC與IpostC的抗損傷效果進(jìn)行了比較,為今后的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

4、此外,還對IpostC抗肝臟缺血再灌注損傷的機制進(jìn)行了探討。
　　 缺血再灌注損傷是多因素參與的復(fù)雜過程,目前認(rèn)為,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的爆發(fā)生成以及由此引發(fā)的過氧化損傷是肝臟缺血-再灌注損傷的重要原因;同時,肝臟Kupffer細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮等多種細(xì)胞激活并釋放炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleuki

5、n-1,IL-1)等也在肝臟缺血-再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此,我們探討了抗氧化系統(tǒng)及致炎性細(xì)胞因子-TNF-α、IL-1在IpostC抗肝缺血.再灌注損傷中的作用。
　　 在肝臟缺血.再灌注過程中,細(xì)胞在遭受缺血、缺氧損傷刺激的作用下必然同時啟動自身的防御性機制,缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)作為缺氧感受器,是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的重要的核轉(zhuǎn)錄因子,由α和β亞基組

6、成。缺氧時HIF-1可作為基因調(diào)節(jié)蛋白與靶基因結(jié)合,促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄,目前已知有100多種靶基因的表達(dá)受其調(diào)節(jié),可引起細(xì)胞對缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng),如:促進(jìn)紅細(xì)胞生成,調(diào)節(jié)血管功能,以及促進(jìn)糖酵解方面有重要作用。組織細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定性和活性受到脯氨酸羥化酶(prolinehydroxylases,PItDs)的嚴(yán)密調(diào)控,PHDs是催化降解HIF-1的限速酶。缺血再灌注損傷的前提是缺血缺氧,缺氧可啟動HIF-1/PHD系統(tǒng),但再灌注

7、后細(xì)胞內(nèi)已激活的HIF-1/PHD系統(tǒng)如何變化,以及該系統(tǒng)在再灌注損傷時的作用等,迄今尚未見報告。為此,本研究進(jìn)一步觀察了IpostC對再灌注早期小鼠肝組織中HIF-1/PHD系統(tǒng),及其靶基因——血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影響,為進(jìn)一步闡明缺血再灌注損傷及IpostC的保護(hù)作用機制提供新思路,為IpostC未來的研究和臨床應(yīng)用提供堅實的理論基礎(chǔ)。
　　 方

8、法
　　 一、動物模型復(fù)制
　　 (一)缺血預(yù)處理(IpreC)動物模型復(fù)制:
　　 1、肝臟缺血預(yù)處理組(IpreC-H):分離并暴露門靜脈,應(yīng)用3個循環(huán)的缺血5min/再灌注5min后,結(jié)扎門靜脈。缺血30min,再灌注1h。
　　 2、雙下肢缺血預(yù)處理組(IpreC-L):雙下肢輪扎,應(yīng)用3個循環(huán)的缺血10min/再灌注10min后,分離并結(jié)扎門靜脈,缺血30min,再灌注1h。
　　 3、

9、對照組(Control):分離并結(jié)扎門靜脈,缺血30min,再灌注1h。
　　 (二)缺血后處理(IpostC)動物模型復(fù)制:
　　 1、IpostC-1:分離并結(jié)扎門靜脈,缺血30min,再灌注起始采用3個循環(huán)10s灌注/10s阻斷(10son/10soff)后,灌注1h。
　　 2、IpostC-2:分離并結(jié)扎門靜脈,缺血30min,再灌注起始采用3個循環(huán)30s灌注/30s阻斷(30son/30soff)后,

10、灌注1h。
　　 3、IpostC-3:分離并結(jié)扎門靜脈,缺血30min,再灌注起始采用3個循環(huán)1min灌注/1min阻斷(1minon/1minoff)后,灌注1h。
　　 (三)缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理動物模型復(fù)制:
　　 1、肝臟缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理組(IpreC-H/IpostC-2):分離并結(jié)扎門靜脈,應(yīng)用3個循環(huán)的缺血5min/再灌注5min后,缺血30min,再灌注起始采用3個循環(huán)30s灌注/3

11、0s阻斷(30son/30soff)后,灌注1h。
　　 2、雙下肢缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理組(IpreC-L/IpostC-2):雙下肢輪扎,應(yīng)用3個循環(huán)的缺血10min/再灌注10min后,分離并結(jié)扎門靜脈,缺血30min,再灌注起始采用3個循環(huán)30s灌注/30s阻斷(30son/30soff)后,灌注1h。
　　 二、各項指標(biāo)檢測
　　 (一)采用全自動生化分析儀測定各組小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙

12、轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性:采集各組小鼠頸靜脈血0.5ml,常溫下1200rpm離心2min,取血清,用全自動生化分析儀測定各組血清AST、ALT水平。
　　 (二)采用分光光度比色法測定小鼠肝組織中總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性,評價抗氧化機制在IpostC抗肝缺血-再灌注損傷中的作用:再灌注1h后

13、處死小鼠,冰上取肝組織,用生理鹽水制成10%肝組織勻漿,低溫離心,取上清液,按試劑盒說明書分別測定總抗氧化能力和MDA的含量及SOD、CAT、NOS、GSH-PX活性。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組的蛋白含量。
　　 (三)采用雙抗體央心ABC-ELISA法檢測小鼠血清中。TNF-α和IL-1的濃度:采集各組小鼠頸靜脈血0.5ml,常溫下1200rpm離心2min,取血清,分別按照小鼠TNF-α、IL-1ELISA檢測試劑盒說

14、明,在波長492nm處檢測小鼠血清中TNF-α和IL-1的含量。
　　 (四)采用RT-PCR法測定肝組織中TNF-α和IL-1 mRNA的表達(dá)情況:再灌注1h后處死小鼠,冰上取肝組織,參照RNAout說明書分別提取各組肝組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件,參見TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver3.0,PCR過程:根據(jù)Gene Bank報告的序列設(shè)計TNF-α和IL-1 mRNA的引物,序列如下:<

15、br>　　 TNF-α:sense5'-CCACCATCAAGGACTCAA-3'Antisense5'-GTCACCAAATCAGCGTTA-3',456bp;
　　 IL-1:sense5'-GAGATTGAGCTGTCTGCT-3'Antisense5'-GGAGAACCAAGCAACGAC-3'313bp;
　　 (五)采用RT-PCR法和Western Blot法分別測定各組肝組織中HIF-1、PHD、VEG

16、F mRNA和蛋白表達(dá)情況:再灌注1h后處死小鼠,冰上取肝組織,參照RNAout說明書分別提取各組肝組織總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件,參見TaKaRaRNA PCR Kit(AMV)Ver3.0,PCR過程:根據(jù)Gene Bank報告的序列設(shè)計HIF-1α、PHD、VEGF mRNA的引物,序列如下:
　　 HIF-1α:sense5'-GGTATTATTCAGCACGACT-3'Antisense5'-ACTTG

17、GGTAGAAGATGGAG-3',445bp;
　　 PHD:sense5'-CTCAGCAGTATGGTGTCCGT-3'Antisense5'-ATACACTCTTGGGCAGGAAC-3'525bp;
　　 VEGF:sense5'-GTCGGGTGGGAGTTATGG-3'Antisense5'-GACGAGGTTTGAGGAAGG-3',154bp;
　　 Western Blot法所需兔抗鼠HIF-

18、1、PHD、VEGF的一抗,購自abcam公司,按1:500稀釋:再灌注1h后處死小鼠,冰上取肝組織,加RIPA裂解液充分裂解,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組的蛋白含量,調(diào)蛋白濃度行SDS-PAGE凝膠電泳,用PVDF膜行轉(zhuǎn)膜:90V,90min。脫脂奶粉封閉,洗膜,一抗4℃孵育過夜,沈膜,二抗孵育2h,ECL化學(xué)發(fā)光設(shè)備處成像。
　　 三、應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　 實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x

19、±SD)表示,組間比較采用方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果
　　 一、缺血后處理對缺血-再灌注損傷肝臟的保護(hù)作用研究
　　 (一)不同方式的缺血后處理對缺血-再灌注肝臟的保護(hù)作用:與對照組相比,IpostC-2和IpostC-3組在再灌注1h后谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性明顯降低(P＜0.05),IpostC-2組降低更明顯,差異非常顯著(P＜0.01);IpostC-1組AL

20、T和AST活性無降低。結(jié)果提示IpostC-2組具有顯著的抗肝缺血-再灌注損傷、保護(hù)肝功能的作用。
　　 (二)與對照組相比,IpreC-H、IpreC-L、IpostC-2、IpreC-H/IpostC-2和IpreC-L/IpostC-2組ALT、AST活性均明顯降低,差異顯著(P＜0.05)。與IpreC和IpostC相比,IpreC/IpostC聯(lián)合應(yīng)用組ALT和AST值進(jìn)一步降低,差異顯著(P＜0.01)。結(jié)果提示聯(lián)合

21、應(yīng)用IpreC和IpostC能提供相加的抗肝缺血再灌注損傷作用。
　　 二、缺血后處理抗氧化機制的研究
　　 與對照組相比,IpostC-2和IpostC-3組在再灌注1h時肝組織中總抗氧化能力增強,MDA檢測過氧化脂質(zhì)生成減少,而SOD、NOS、CAT和GSH-PX活性增高(P＜0.05),以IpostC2組各項指標(biāo)變化更明顯:IpostC1組各項指標(biāo)無明顯改善。與單獨應(yīng)用IpreC和IpostC相比,聯(lián)合應(yīng)用Ipre

22、C和IpostC能進(jìn)一步改善缺血再灌注肝組織中抗氧化酶系統(tǒng)SOD、GSH-PX、NOS和CAT的活性,提高肝組織總抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的生成。結(jié)果提示IpostC具有抗氧化損傷作用,聯(lián)合應(yīng)用IpreC和IpostC能提供相加的抗氧化損傷效果。
　　 三、缺血后處理對炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　 與對照組相比,IpreC組、IpostC2組、IpreC-H/IpostC-2組和IpreC-L/IpostC-2組小鼠

23、血清中TNF-α和IL-1的濃度明顯降低(P＜0.05),肝組織中TNF-α和IL-1mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與單獨應(yīng)用IPreC和IPostC相比,聯(lián)合應(yīng)用IPreC-IPostC對TNF-α和IL-1表達(dá)的影響不顯著。結(jié)果提示IpreC、IpostC2、IpreC-H/IpostC-2和IpreC-L/IpostC-2可抑制kupffer細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá),但聯(lián)合應(yīng)用IpreC和IpostC未能產(chǎn)生相加的抑制效果

24、。
　　 四、缺血后處理對HIF-1/PHD系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)蛋白的影響
　　 與對照組相比,IpreC組、IpostC2組、IpreC-H/IpostC-2組和IpreC-L/IpostC-2組小鼠肝組織中HIF-1和VEGF mRNA的表達(dá)顯著增加(P＜0.05),其Western-Blot結(jié)果在蛋白水平證實肝臟HIF-1和VEGF的含量與對照組相比明顯增加(P＜0.05);與對照組相比,IpreC、IpostC組、Ipr

25、eC-H/IpostC-2和IpreC-L/IpostC-2組小鼠肝組織中PHD mRNA的表達(dá)減少(P＜0.05),Western-Blot檢測結(jié)果顯示,PHD的蛋白含量與對照組相比明顯降低(P＜0.05)。與單獨應(yīng)用IpreC和IpostC相比,聯(lián)合應(yīng)用IpreC-IpostC可顯著增加小鼠肝組織中HIF-1和VEGF mRNA的表達(dá)(P＜0.05)和對應(yīng)的蛋白濃度,同時可抑制PHD的表達(dá)。結(jié)果提示,IpostC抗肝臟缺血-再灌注損

26、傷的機制與細(xì)胞的缺氧應(yīng)答反應(yīng)密切相關(guān),可通過刺激該應(yīng)答反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子-HIF-1的表達(dá)并保護(hù)其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,發(fā)揮其調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄與合成功能,促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)缺氧,提高組織抵抗缺血-再灌注損傷的能力。聯(lián)合應(yīng)用IpreC和IpostC能產(chǎn)生相加的保護(hù)效果。
　　 結(jié)論
　　 1、缺血后處理能夠保護(hù)肝功能,具有抗小鼠肝缺血-再灌注損傷作用。再灌注起始采用3個循環(huán)30s灌注/30s阻斷(30son/30soff)的方案抗小鼠

27、肝缺血-再灌注損傷的效果最好。
　　 2、聯(lián)合應(yīng)用缺血預(yù)處理和缺血后處理可以提供相加的保護(hù)作用,其中遠(yuǎn)端肢體缺血預(yù)處理與缺血后處理的聯(lián)合應(yīng)用尚屬首次,該方案操作簡便易行,對機體損傷小,可明顯提高缺血后處理對缺血-再灌注肝臟的保護(hù)效應(yīng)。
　　 3、缺血后處理抗小鼠缺血.再灌注肝損傷作用與抗氧化作用機制有關(guān),缺血后處理可增強缺血-再灌注肝組織總抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的生成,通過提高抗氧化物質(zhì)SOD、GSH-PX、NOS

28、和CAT的活性減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng),發(fā)揮抗肝臟缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。聯(lián)合應(yīng)用IpreC-IpostC可產(chǎn)生相加的抗氧化效果。
　　 4、缺血后處理能夠抑制小鼠缺血-再灌注肝組織中炎性細(xì)胞因子的合成與分泌,減輕缺血-再灌注肝臟的炎性損傷。IpreC-IpostC的聯(lián)合應(yīng)用未能產(chǎn)生相加的抑制效果,可能與缺血-再灌注損傷發(fā)生的時相以及IpreC、IpostC各自發(fā)揮保護(hù)作用的機制相關(guān)。
　　 5、缺血后處理能夠促進(jìn)肝細(xì)胞發(fā)