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文檔簡介
1、目的:
創(chuàng)傷后的瘢痕增生,是由于細胞外基質(zhì)的過度沉積或者降解減少而產(chǎn)生,給患者帶來疼痛,瘙癢,畸形和甚至毀容等問題。但其產(chǎn)生的生物學調(diào)控機制仍然不詳,目前臨床上并沒有較有效的治療手段。MicroRNA(微小 RNA)是一種可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的內(nèi)源性非編碼小分子 RNA,在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)HS(Hypertrophic scar增生性疤痕)組織中miR-31(MicroRNA-31)表達量最高,它的出現(xiàn)可能會給我們提
2、供新的思路和治療靶點。HIF1α(hypoxia inhibit factor1α缺氧誘導因子1α)在近年來的研究中被發(fā)現(xiàn)對疤痕的產(chǎn)生有促進作用,但具體機制仍不清楚。本文我們將探索miR-31與HIF1α是如何促進疤痕的增生,二者間是否存在影響,并通過裸鼠體內(nèi)試驗來驗證miR-31作用的有效性。本實驗深入的研究了miR-31在增生性瘢痕形成中的作用及生物學機制,并為增生性疤痕的預防和臨床治療提供了理論依據(jù)和新的切入點。
方法:
3、
1、正常皮膚真皮組織及增生性瘢痕真皮組織的樣本采集;福爾馬林溶液浸泡后用石蠟進行包埋固定,切片給予HE染色、Masson染色和免疫組化染色;RT-PCR檢測正常皮膚真皮組織和增生性瘢痕組織中miR-31的相對表達差異;WB(western blot)檢測NS(Normal skin正常皮膚組織)與HS組織中HIF1α的蛋白表達差異。
2、進行人NSFBs(Normal skin fibroblasts正常皮膚成纖維
4、細胞)和HSFBs(Hypertrophic scar fibroblats增生性疤痕成纖維細胞)的培養(yǎng),RT-PCR對不同代次細胞檢測其miR-31;Fn(Fibronectin纖維鏈接蛋白);Col1a1(collage1a1膠原1 a1);Col3a1(collage3a1膠原3 a1);TGF-β(Transforming growth factor beta轉(zhuǎn)化生長因子-β)的表達量,驗證細胞模型構建的可用性。構建miR-31
5、過表達干擾載體,并轉(zhuǎn)染入NSFBs;反義干擾載體,并轉(zhuǎn)染入HSFBs。RT-PCR、WB檢測轉(zhuǎn)染后細胞的miR-31;Fn;Col1a1;Col3a1的表達量,從而觀察miR-31對成纖維細胞生物學特性的影響。
3、檢索生物信息數(shù)據(jù)庫,包括:Targetscan, miRanda,PicTar等,通過計算機運算非翻譯區(qū)的核苷酸結合度來預測miR-31的靶基因,篩選與缺氧相關的特定靶基因FIH(Factor inhibit HI
6、F缺氧誘導因子抑制因子)。螢火素酶報告及RT-PCR、WB檢測轉(zhuǎn)染后細胞的FIH的表達量,驗證miR-31靶向抑制FIH。
4、RT-PCR、WB檢測細胞過表達和反義表達miR-31后,HIF1α;TIMP-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase基質(zhì)金屬蛋白抑制因子1);MMP1(matrix metalloproteinases-1基質(zhì)金屬蛋白酶-1)的表達量,從而觀察miR-31對H
7、IF1α及其下游調(diào)控蛋白的影響。
5、將 HSFBs培養(yǎng)于缺氧的環(huán)境中,并于24h;48h;72h三個時間節(jié)點檢測Fn;Col1a1;Col3a1;TIMP-1;MMP1的蛋白表達量,從而闡明HIF1α促進疤痕增生的原因。
6、建立體外裸鼠疤痕模型,觀察miR-31抑制劑局部干預后Fn;Col1a1;Col3a1的表達量變化。
結果:
HS組織及細胞中miR-31及HIF1α表達量都顯著升高,體外
8、實檢測到Fn;Col1a1; Col3a1三個纖維化指標的表達量與miR-31呈正相關,從而得出miR-31可以促進HS的發(fā)生。此外HIF1α與miR-31在成纖維細胞中有類似的作用,也可以促進纖維化指標的表達,成纖維細胞梯度低氧實驗驗證了TIMP-1是HIF1α的下游作用基因,與HIF1α的表達正相關。MMP1已多次被驗證有促進Fn;Col1a1;Col3a1降解的作用,而TIMP-1是MMP1的抑制因子,所以隨著缺氧的加深,纖維化指
9、標的過度表達是通過增強TIMP-1對MMP1的抑制作用而實現(xiàn)的。FIH是缺氧誘導因子的抑制因子,它可以抑制HIF1α對下游基因的轉(zhuǎn)錄誘導作用。螢火素酶報告,RT-PCR及WB實驗得出FIH是miR-31的靶基因,并且HIF1α對疤痕的這一促進作用可以被miR-31所增強。綜上我們得出miR-31增強HIF1α-TIMP-1-MMP1通路促進HS發(fā)生。為了進一步驗證miR-31在HS中作用的確定性,設計動物實驗。miR-31抑制劑局部干預
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