探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1蛋白轉(zhuǎn)錄新功能.pdf

1、目的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制和神經(jīng)酰胺合成功能方面已經(jīng)做過大量研究，但其轉(zhuǎn)錄功能研究甚少。本研究通過構(gòu)建含有TMSG-1蛋白不同功能域的真核重組質(zhì)粒并觀察各重組質(zhì)粒在亞細(xì)胞的定位，以確定基因內(nèi)部的核定位信號，探索TMSG-1蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的新功能。
　　方法以TMSG-1真核表達(dá)載體為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增TMSG-1基因全長和不同截斷體片段，與帶有Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pcDNA3連接，轉(zhuǎn)化感

2、受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)氨芐青霉素篩選陽性克隆，菌液提取質(zhì)進(jìn)行粒酶切初步鑒定，后由上海生物工程公司測序鑒定。將序列正確的各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Western bloting鑒定蛋白表達(dá)。免疫熒光檢測各個截斷體亞細(xì)胞定位。通過TMSG-1基因結(jié)構(gòu)分析，對預(yù)測的核定位序列進(jìn)行缺失研究，構(gòu)建QST5重組質(zhì)粒并觀察亞細(xì)胞定位改變。
　　結(jié)果 PCR成功擴(kuò)增得到目的基因片段，并構(gòu)建得到TMSG-1全長及不同截斷片段T1(aa129-aa3

3、80)、T2(aa71-aa380)、T3(aa1-aa128)、T4(aa1-aa70)、T5(aa71-aa128)和核定位信號缺失體QST5(aa71-aa118)的真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切初步鑒定及基因測序鑒定，各重組質(zhì)?；蛐蛄腥空_，Western bloting檢測結(jié)果表明各重組的真核表達(dá)載體均有預(yù)期長度的蛋白表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明，含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域的截斷體T2、T3及T5能夠入核，其中T2在核內(nèi)彌漫分布，而

4、T3及T5主要定位于細(xì)胞核的核仁部位，缺失預(yù)測核定位信號(NLS)序列的QST5仍定位于細(xì)胞核，但其熒光信號不集中在核仁。不含Homeodomain結(jié)構(gòu)域的T1和T4定位于細(xì)胞漿。
　　結(jié)論成功構(gòu)建TMSG-1全長及不同截斷片段的真核表達(dá)載體并成功表達(dá)，確定TMSG-1蛋白含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域的截斷體能夠入核，而缺失Homeodomain結(jié)構(gòu)域中預(yù)測的核定位序列的截斷體能定位于細(xì)胞核，卻不再集中于核仁，初步確定其核定位