LASS2基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、本研究的目的是通過構(gòu)建人源性LASS2基因的真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定過表達(dá)LASS2蛋白的HCCLM3細(xì)胞株，來研究LASS2基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制。 本研究分三部分進(jìn)行。 在第一部分中，著重于LASS2基因?qū)CCIJM3肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響的研究，分三組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。 1、LASS2基因在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌中表達(dá)情況的檢測： Northern blot結(jié)果顯示，高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系HCCLM3中LASS

2、2基因的表達(dá)水平比低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系MHCC97-L要低；對20例臨床肝癌樣本原位癌組織(已轉(zhuǎn)移組10例，未轉(zhuǎn)移組10例)的檢測結(jié)果顯示，已轉(zhuǎn)移組的IASS2基因的表達(dá)水平比未轉(zhuǎn)移組低。 2、LASS2基因?qū)CCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響的體外實(shí)驗(yàn)： 通過構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA2-IASS2，并將其轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系HCCLM3，經(jīng)G418篩選，我們建立了穩(wěn)定過表達(dá)IASS2基因的HCCIM3細(xì)胞系。通過

3、劃痕實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了LASs2基因在HCCLM3細(xì)胞中過表達(dá)后，HCCLM3細(xì)胞在遷移、侵襲等轉(zhuǎn)移能力上受到了明顯的抑制。 3、LASS2基因?qū)CCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響的裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，當(dāng)IASS2基因穩(wěn)定過表達(dá)時，HCCLM3細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到抑制。同時，我們采用原位酶譜方法，對裸鼠的肝移植瘤組織進(jìn)行MMP-2/MMP-9的活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)HASS2基因抑制了HCCLM3細(xì)胞MMP

4、-2/MMP-9的激活。 LASS2基因在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌中低表達(dá)，在低轉(zhuǎn)移潛能肝癌中高表達(dá)；綜合體外及體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以及LASS2基因在HCCLM3細(xì)胞過表達(dá)后，HCCLM3細(xì)胞MMP-2/MMP-9在激活方面的變化，這些證實(shí)LASS2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞HCCLM3的轉(zhuǎn)移具有顯著地抑制作用；結(jié)合在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)LASS2與V-ATPase的ATP6L亞基相互結(jié)合，提示LASS2基因抑制肝癌細(xì)胞HCCLM3轉(zhuǎn)移的機(jī)制可

5、能與LASS2蛋白結(jié)合ATP6L亞基后抑制V-ATPase的活性相關(guān)。 在第二部分中，著重于LASS2對V-ATPase泌氫功能影響的研究，分三組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。 1、LASS2與ATP6L相互結(jié)合的研究： 通過蛋白亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)、co-IP(Co-immunoprecipitation，CO-IP)實(shí)驗(yàn)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)等

6、實(shí)驗(yàn)，我們確認(rèn)LASS2與ATP6L可以相互結(jié)合；在蛋白亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)ATP6L的定位發(fā)生改變。 2、LASS2對ATP6L影響的研究： 熒光淬滅后能量恢復(fù)實(shí)驗(yàn)(Fluorescence recovery after photobleaching，F(xiàn)RAY)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，LASS2蛋白可以抑制ATP6L蛋白的運(yùn)動。 3、LASS2對V-ATPase泌氫功能影響的研究： ATP6L的norther

7、n blot檢測結(jié)果顯示，LASS2基因在HCCLM3細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定過表達(dá)后，ATP6L的表達(dá)并未發(fā)生明顯改變，LASS2基因在HCCLM3細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定過表達(dá)后，ATP6L的表達(dá)并未發(fā)生明顯改變，但LASS2組細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時后細(xì)胞泌氫較對照組減少，且LASS2組細(xì)胞的pHi在NH4<'+>誘導(dǎo)酸化后恢復(fù)受阻；同時，用激光共聚焦顯微鏡對活細(xì)胞進(jìn)行觀測時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞處于對酸過載的反應(yīng)期時，對照組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)ATP6L-GFP蛋白的局部富集，

8、而LASS2組細(xì)胞內(nèi)的ATP6L-GFP蛋白未發(fā)生變化。 通過蛋白亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)、CO-IP實(shí)驗(yàn)、FRET等實(shí)驗(yàn)，我們確認(rèn)LASS2與ATP6L可以相互結(jié)合；FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，LASS2蛋白可以抑制ATP6L蛋白的運(yùn)動；LASS2組細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時后細(xì)胞泌氫較對照組減少，且LASS2組細(xì)胞的pHi在NH4<'+>誘導(dǎo)酸化后恢復(fù)受阻；激光共聚焦顯微鏡的觀測結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞處于對酸過載的反應(yīng)期時，對照組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)ATP6

9、L-GFP蛋白的局部富集，而LASS2組細(xì)胞內(nèi)的ATP6L-GFP蛋白未發(fā)生變化。上述結(jié)果證實(shí)LASS2基因?qū)-ATPase的泌H<'+>能力具有抑制作用，并提示其作用機(jī)制與LASS2蛋白結(jié)合ATP6L亞基并抑制其運(yùn)動相關(guān)。 在第三部分中，著重于LASS2影響HCCLM3細(xì)胞對酸性微環(huán)境應(yīng)答的研究，分三組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。 1、在酸性微環(huán)境中，LASS2對HCCLM3細(xì)胞溶酶體影響的研究： 我們使用吖啶橙染料對活細(xì)胞的

10、溶酶體進(jìn)行染色，使用激光共聚焦顯微鏡對活細(xì)胞進(jìn)行觀測。成像結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基由堿性(pH7.4)變?yōu)樗嵝?pH6.6)時，對照組細(xì)胞內(nèi)的溶酶體由核周向細(xì)胞邊緣及細(xì)胞觸角內(nèi)遷移，而LASS2組細(xì)胞內(nèi)溶酶體的位置無改變。 2、在酸性微環(huán)境中，LASS2對HCCLM3細(xì)胞MMP-2影響的研究： 當(dāng)LASS2組與對照組細(xì)胞分別用不同pH值(pH7.4、pH 7.0、pH 606)的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)后，通過對細(xì)胞蛋白及無血清細(xì)胞培養(yǎng)

11、上清用MMP-2抗體進(jìn)行western blot檢測，結(jié)果顯示，LASS2基因?qū)?xì)胞內(nèi)的MMP-2合成并無影響，但抑制細(xì)胞MMP-2的分泌。而以明膠(A型)為底物的進(jìn)行Zymographv分析及細(xì)胞原位酶譜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示LASS2組細(xì)胞MMP-2的激活受到了明顯的抑制。當(dāng)細(xì)胞外周微環(huán)境向酸性變化時，LASS2依然抑制MMlP-2的分泌與激活。 3、在酸性微環(huán)境中，LASS2對HCCIM3細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響的研究： 體外腫瘤細(xì)胞

12、侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞外周微環(huán)境向酸性變化時，LASS2依然明顯抑制HCCLM3細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，LASS2蛋白結(jié)合ATP6L亞基后，通過抑制ATP6L在細(xì)胞內(nèi)的移動，不僅導(dǎo)致V-ATPase的失活，還導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體在酸性微環(huán)境的下無法從胞核周向細(xì)胞觸角及細(xì)胞膜邊緣遷移，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MMP-2的分泌與激活受到明顯的抑制，并造成腫瘤細(xì)胞在酸性微環(huán)境下的轉(zhuǎn)移能力無明顯改變。 本