非肽性化合物AVE0991對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、研究背景：
　　 心肌細(xì)胞肥大和血管平滑肌細(xì)胞增殖是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的危險(xiǎn)因素，是心肌梗塞及高血壓等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥。因此，如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)和血管平滑肌細(xì)胞增殖是改善許多心血管疾病預(yù)后的重要措施。
　　 血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]在體內(nèi)由血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)或AngⅡ經(jīng)轉(zhuǎn)化而成。近年細(xì)胞培養(yǎng)和離體研究表明，它可通過一種特異性受體-Mas受體，介導(dǎo)許多與AngⅡ相拮抗

2、的生理作用。在改善心肌細(xì)胞肥大、抑制成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)水鹽平衡以及降血壓等方面發(fā)揮重要的作用。
　　 但是，Ang-(1-7)是一種肽類活性物質(zhì)，不能耐受胃腸道蛋白水解酶從而限制其臨床應(yīng)用。近年開發(fā)出的非肽性、具有可口服特性的Ang-(1-7)受體類似物AVE0991雖然被證實(shí)是Ang-(1-7)Mas受體的激動(dòng)劑，并已在一些器官上證實(shí)具有與Ang-(1-7)高度相似的機(jī)體保護(hù)作用，但其對(duì)心肌肥大、成纖維細(xì)胞和血管

3、平滑肌細(xì)胞的增殖的影響及其作用機(jī)理尚未明了。
　　 TGF-β1/Smads調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的生成，是心室重塑過程中的中心環(huán)節(jié)。Smad蛋白家族是TGF-β超家族細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中極為重要的介導(dǎo)分子，TGF-β1與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合并磷酸化Smads蛋白后，被激活的Smad蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。但是，TGF-β1/Smads通路是否介導(dǎo)了AVE0991抑制

4、心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞增殖，有待進(jìn)一步探討。
　　 血紅素氧合酶-1(HO-1)是血紅素氧合酶的同工酶之一，HO-1在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均被證實(shí)能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌肥大的進(jìn)展，能調(diào)節(jié)AngⅡ所致的心血管重構(gòu)過程，但非肽性化合物AVE0991是否也通過該通路抑制心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞增殖尚不清楚。
　　 研究表明p38MAPK及其上游MMK3/6激酶激活能導(dǎo)致心肌肥大，p38激酶抑制劑SB203508或SB202

5、190能抑制激動(dòng)劑誘發(fā)的心肌肥大。在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，心肌細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)染活MMK6具有顯著的促心肌肥大作用，MMK3、p38α或p38β缺失轉(zhuǎn)染則抑制心肌肥大形成。表明p38MAPK在抑制心肌肥大中發(fā)揮重要的作用，但AVE0991是否通過p38抑制心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞增殖尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 研究目的：
　　 1.非肽性化合物AVE0991是否能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和血管平滑肌細(xì)胞增殖。
　　 2.非肽性化

6、合物AVE0991是否通過Mas/TGF-β1/Smads，Mas/p38和Mas/HO-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮以上效應(yīng)。
　　 第一部分AVE0991對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.新生原代大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組：細(xì)胞培養(yǎng)48h后，換無血清培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h后，按以下分組加入不同干擾因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：1)對(duì)照組(無血清組)，2)AngⅡ組(10-6mol/L)，

7、3)AVE0991組(10-5mol/L)，4)A-779組(10-6mol/L)，5)AngⅡ+AVE0991高濃度組(濃度分別為10-6mol/L、10-5 mol/L，即“AVE0991-H組”)，6)AngⅡ+AVE0991+A-779組(濃度分別為10-6mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L；在該組中，心肌細(xì)胞先予A-779預(yù)處理半小時(shí))，7)AngⅡ+AVE0991低濃度組(濃度分別為10-6mol/L，10-

8、7mol/L，即“AVE0991-L組”)。通過測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率、蛋白質(zhì)含量和細(xì)胞表面積等指標(biāo)，觀察心肌細(xì)胞肥大情況；并利用Western blot測(cè)定AVE0991對(duì)信號(hào)通路TGF-β1/Smad2、p38的影響。另外，為進(jìn)一步明確其信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1)對(duì)照組(無血清組)，2)AngⅡ組(10-6mol/L)，3)AngⅡ+AVE0991高濃度組(濃度分別為10-6 mol/L、10-5mol/L，即“AVE09

9、91-H組”)，4)AngⅡ+AVE0991+A-779組(濃度分別為10-6mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L；在該組中，心肌細(xì)胞先予A-779預(yù)處理半小時(shí))，5)AngⅡ+AVE0991+SB203580(p38拮抗劑)組(濃度分別為10-6mol/L，10-5mol/L，10-5mol/L”)。各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用spss11.0統(tǒng)計(jì)軟件，以方差分析統(tǒng)計(jì)均數(shù)差異和LSD分析各組之間的差異，P＜0.05為

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.非肽性化合物AVE0991能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，并呈劑量依賴性。
　　 2.非肽性化合物AVE0991可能通過Mas/p38/TGF-β1通路抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 第二部分AVE0991對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.家兔血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組：取第三代

11、血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，換無血清培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h后，按以下分組加入不同干擾因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：1)對(duì)照組(無血清組)，2)AngⅡ組(10-6mol/L)，3)AVE0991組(10-5mol/L)，4)A-779組(10-6mol/L)，5)AngⅡ+AVE0991高濃度組(濃度分別為10-6 mol/L、10-5mol/L，即“AVE0991-H組”)，6)AngⅡ+AVE0991+A-779組(濃度分別為10-6mol/L、1

12、0-5mol/L、10-6mol/L；在該組中，VSMCs先予A-779預(yù)處理半小時(shí))，7)AngⅡ+AVE0991低濃度組(濃度分別為10-6mol/L，10-7mol/L，即“AVE0991-L組”)。通過測(cè)定VSMCs的DNA合成速率觀察血管平滑肌細(xì)胞增殖的情況；并利用Western blot測(cè)定AVE0991對(duì)信號(hào)通路p38、HO-1的影響。另外，為進(jìn)一步明確其信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1)對(duì)照組(無血清組)，2)AngⅡ組(

13、10-6mol/L)，3)AngⅡ+AVE0991高濃度組(濃度分別為10-6mol/L、10-5mol/L，即“AVE0991-H組”)，4)AngⅡ+AVE0991+A-779組(濃度分別為10-6mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L;在該組中，心肌細(xì)胞先予A-779預(yù)處理半小時(shí))，5)AngⅡ+AVE0991+ZnPPⅨ(HO-1抑制劑)組(濃度分別為10-6mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L”)。各