基于基因表達譜的肺腺癌治療藥物篩選及相關實驗研究.pdf

1、肺癌是人類健康的主要“殺手”,也是我國男性和女性最主要致死性癌癥之一,包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌(發(fā)病率約占80％)。肺腺癌屬于非小細胞肺癌(NSCLC),是最常見肺癌之一,發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的20-30％,在許多國家已超過鱗狀細胞癌。目前,臨床采用外科治療、放射治療、化學治療等多種方法綜合治療NSCLC。近年來,NSCLC的治療雖獲得較為快速的進展,但NSCLC的預后及治療仍不理想,包括肺腺癌在內的各類肺癌總體的5年生存率仍非常低

2、(15％以內)。因此,發(fā)現(xiàn)新的高效低毒的治療藥物,對延長病人的生存期及降低肺腺癌等肺癌的死亡率有著重要意義。
　　 綜上,由于肺腺癌屬于最常見的肺癌類型,嚴重威脅人類健康,因此,尋找一些高效、低毒的肺腺癌治療藥物有著迫切的臨床需要。本研究將利用基于基因表達譜的藥物發(fā)現(xiàn)模式,通過計算生物學和系統(tǒng)生物學分析策略“connectivity map”篩選肺腺癌治療候選化合物或藥物,并進行相關的實驗驗證。本研究將為肺腺癌的治療藥物發(fā)現(xiàn)和臨

3、床治療提供理論及實驗依據,同時也加速肺腺癌藥物發(fā)現(xiàn)過程。
　　 本研究內容主要分為三個部分:
　　 第一部分 基于基因表達譜的肺腺癌治療藥物篩選
　　 目的:探討基于基因表達譜的藥物發(fā)現(xiàn)途徑在肺腺癌治療藥物篩選中的應用價值,篩選和發(fā)現(xiàn)新的肺腺癌治療藥物。
　　 方法與結果:
　　 1.從GEO中獲取肺腺癌基因表達譜數(shù)據集:通過Ftp工具,從NCBI的GEO數(shù)據庫中獲得兩個肺腺癌基因表達譜數(shù)據集,即

4、GSE7670和GSE10072,其中,GSE7670數(shù)據集來源于臺灣臺北榮民總醫(yī)院,共64個樣本； GSE10072來源于美國N.I.H遺傳流行病學部,共107個樣本,兩數(shù)據集均采用GPL96芯片平臺。為提高生物信息學分析的質量,我們首先采用RMAexpress軟件對芯片樣本進行了質量分析,刪除偏差大的樣本數(shù)據。最后,從GSE7670獲得36個樣本,包括16個肺腺癌樣本和20個癌旁正常樣本；從GSE10072中獲得43個樣本,包括20

5、肺腺癌樣本和23個癌旁正常樣本。
　　 2.肺腺癌差異表達基因分析 為了獲得肺腺癌共同差異基因表達譜,我們采用BRB軟件分別對GSE10072和GSE7670數(shù)據集進行基因差異表達分析,最終通過Venny作圖工具獲得共同差異表達基因344個,其中上調基因93個,下調基因251個(Fold change>2)。
　　 3.Cmap篩選肺腺癌治療藥物 首先,我們建立肺腺癌gene query signature文件,然后通過

6、cMAP在線分析工具進行肺腺癌候選藥物篩選,結果表明,熱休克90抑制劑(tanespimycin,monorden,alvespimycin,geldanamycin)、HDAC抑制劑(trichostatin A,vorinostat)、PPAR受體激動劑(15-delta prostaglandin J2,troglitazone,pioglitazone,bufexamac)與PI3K抑制劑(LY-294002)等4類藥物負性富集

7、分數(shù)較高,可較好的逆轉肺腺癌基因表達譜,提示這些藥物可能成為肺腺癌治療候選藥物。
　　 結論:基于基因表達譜的藥物發(fā)現(xiàn)途徑應用于肺腺癌治療候選藥物發(fā)現(xiàn)是可行的。通過本研究篩選到一些肺腺癌候選治療藥物,為下一步實驗研究提供理想的候選藥物或化合物,加速了藥物發(fā)現(xiàn)過程。
　　 第二部分 17-AAG對肺腺癌A549細胞的增殖抑制作用
　　 目的:在第一部分,我們篩選到多類肺腺癌治療候選化合物,特別是多種Hsp90抑制劑

8、(如tanespimycin(17-AAG),monorden,alvespimycin及geldanamycin等)被篩選到,其中17-AAG負性富集分數(shù)最高,它是格爾德霉素衍生物,目前正在進行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗。本部分主要觀察17-AAG對肺腺癌A549細胞的增殖抑制作用,并觀察17-AAG對A549細胞周期和細胞凋亡的影響。
　　 方法與結果:
　　 1.17-AAG對肺腺癌A549細胞的增殖抑制作用:采用MTT法測

9、定17-AAG對A549的增殖抑制作用,實驗分不同濃度17-AAG組(0.2、0.4、0.8、1.6及3.2 μM)、陰性對照組及空白對照組,藥物處理時間為24h、36 h、48h。結果顯示:不同的劑量組對A549細胞的生長抑制作用有統(tǒng)計學差異(F=586.02,P=0.000)；同一劑量3個不同時間點有統(tǒng)計學差異(F=116.262,P=0.000)；劑量與時間占之間有交互效應(F=18.789,P=0.000)。17-AAG作用24

10、h、36h及48h時,其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.539、0.884和0.455μM,提示17-AAG對A549細胞的生長抑制呈現(xiàn)一定的時間依賴性。
　　 2.17-AAG對A549細胞的細胞周期阻滯作用:通過流式細胞技術分析各種濃度17-AAG作用A54924h后細胞周期的變化,結果表明:0.11μM、0.23μM及0.45μM劑量組G2/M期細胞比例分別為(12.93±0.29)％、(20.57±0.29)％和(23

11、.00±3.64)％,與對照組(6.03±0.95％)相比有統(tǒng)計學差異(P<0.001),但0.23μM和0.45μM兩劑量組之間無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.17-AAG對A549細胞凋亡誘導作用 不同劑量17-AAG作用A54924h后,通過Annexin-Ⅴ和PI雙染法檢測A549細胞凋亡的變化。結果表明,17-AAG可誘導A549發(fā)生凋亡,其凋亡誘導效應與劑量有關。與陰性對照相比,0.11μM17-AAG組早期

12、凋亡率無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0.23μM 17-AAG組晚期凋亡率(11.86±0.951％)高于對照組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05),但早期凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05):0.45μM 17-AAG組早期凋亡率(9.35±0.547％)和晚期凋亡率(21.316±1.036％)均高于對照組,有統(tǒng)計學差異(P<0.005)。與低、中劑量組相比,0.45μM 17-AAG組早期和晚期凋亡率均明顯增加,有統(tǒng)計學差異(P<0.00

13、5)。
　　 結論:17-AAG抑制A549細胞增殖,引起A549細胞在G2/M期產生阻滯,并誘導A549細胞凋亡.
　　 第三部分 17-AAG協(xié)同順鉑抑制肺腺癌細胞的增殖
　　 目的:順鉑是治療非小細胞肺癌最為常用的基礎化療藥物,但單用具有副作用多、毒性大及產生耐藥性等缺點,故尋找高效低毒的順鉑增敏劑有重要臨床意義。我們的研究表明,17-AAG可有效的抑制肺腺癌A549細胞增殖,導致細胞周期G2/M阻滯,并誘

14、導肺腺癌細胞凋亡,本部分將探討17-AAG與順鉑的聯(lián)用是否產生協(xié)同效應,為17-AAG治療肺腺癌提供實驗依據。
　　 方法與結果:
　　 1.MTT法檢測17-AAG聯(lián)合順鉑對A549細胞的增殖抑制作用。實驗分:對照組、各種劑量順鉑組(4.4,8.7,17.5,35及70μM)、不同劑量17-AAG組(0.025,0.05,0.1,0.2及0.41μM)和上述各濃度兩藥物聯(lián)合組(17-AAG+順鉑組),A549細胞分別與

15、各種藥物孵育48h。應用中效原理對17-AAG和順鉑聯(lián)合用藥作用進行評價,發(fā)現(xiàn)17-AAG和順鉑聯(lián)合可產生良好協(xié)同抑制效應,合用時中效濃度及各自所需用量均比單用時要小:順鉑單用時Dm為69.627μM,合用時Dm為16.19μM,合用時比單用時小4.3倍；而17-AAG單用時Dm為0.4547μM,合用時Dm為0.093μM,合用時比單用時小4.89倍。按中效原理,我們得出17-AAG與順鉑兩藥合用的效應與合用指數(shù)關系,隨著兩藥劑量的增

16、加,其效應fa和CI也相應增加,當效應fa>0.8時,兩藥合用指數(shù)CI>1,產生拮抗效應；fa<0.8時,CI<1,兩藥合用產生協(xié)同作用,即17-AAG<1.24μmol/L與順鉑<217μmol/L的劑量聯(lián)合用藥時,可產生協(xié)同作用。
　　 2.17-AAG與順鉑聯(lián)合應用對細胞周期影響 A549細胞分別經各劑量17-AAG(0.12μM,0,23μM或0.45μM)+70μM ciplatin處理24h之后,采用流式細胞技術分析

17、17-AAG與順鉑聯(lián)合應用之后細胞周期變化。結果表明:當17-AAG與順鉑聯(lián)合作用后,與對照組相比較,細胞周期G1期和G2/M期細胞比率無統(tǒng)計學差異(P>0.05),僅在0.45 μmol/L 17-AAG與70μmol/的順鉑聯(lián)用時,發(fā)現(xiàn)S期細胞比率增加,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 3.17-AAG與順鉑聯(lián)合應用對細胞凋亡影響 A549細胞經17-AAG或順鉑或17-AAG+順鉑處理24h之后,通過Annexin Ⅴ

18、-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡變化。結果表明:各藥物組之間早期凋亡率(F=97.60,P=0.000)和晚期凋亡率(F=645.01,P=0.000)有統(tǒng)計學差異。與順鉑單劑量用藥相比,低劑量(0.12μM)17-AAG與順鉑合用其早及晚期凋亡率無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但17-AAG在較大劑量下與順鉑聯(lián)用后,早及晚期凋亡率有統(tǒng)計學差異(P<0.005),尤其是壞死細胞和晚期凋亡率統(tǒng)計學差異顯著(P<0.001)。