非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)在重癥肌無(wú)力患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:
　　重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是比較常見(jiàn)的神經(jīng)肌肉疾病，是細(xì)胞免疫依賴(lài)性、補(bǔ)體參與和自身反應(yīng)抗體介導(dǎo)引起神經(jīng)肌接頭(neuromuscularjunction，NMJ)處傳遞障礙的自身免疫性疾病，自身抗體作用的靶點(diǎn)為NMJ處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor, AChR)。重癥肌無(wú)力患者血清中存在多種自身抗體，其中約85％為乙酰膽堿受體抗體(acetylchol

2、ine receptorantibody, AChRab)，其余的自身抗體包括:肌肉特異性激酶抗體(muscle specifickinase antibody，MuSKab)，低密度脂蛋白受體抗體(low density lipoproteinantibody，LRP-4ab)，以及其他自身抗體。由于AChRab與AChR結(jié)合，使后者發(fā)生降解，從而引起骨骼肌反復(fù)活動(dòng)后易疲勞癥狀。在前期研究中，免疫組化發(fā)現(xiàn)MG患者伴胸腺增生組與正常對(duì)照

3、組相比，煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinicacetylcholine receptor, nAChR)表達(dá)減少，且在針對(duì)MG胸腺非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)（non-neuronal cholinergic system，NNCS）相關(guān)組分分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)存在明顯差異(α1，α9，M3,α2，β2)。胸腺是自身反應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)育的器官，正常人外周血中成熟的單個(gè)核細(xì)胞存在NNCS，差異表達(dá)的NNCS組分會(huì)影響機(jī)體免疫和抗體的產(chǎn)生。
　　本

4、研究旨在觀察其是否與胸腺表達(dá)NNCS存在聯(lián)系，分析MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)NNCS的表達(dá)，探討其對(duì)自身抗體產(chǎn)生的影響。
　　方法:
　　選取20例無(wú)吸煙史的健康志愿者（男10例，女10例）和30例來(lái)自鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院和河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院MG患者（男13例，女17例），年齡25～57（39.4±10.4）歲，抽取肘正中靜脈血6ml置于肝素抗凝

5、管中，MG患者僅服用溴吡斯的明片或者未曾服用藥物，不伴其他自身免疫性疾病。采集標(biāo)本時(shí)取得患者的同意，所有患者均簽署知情同意書(shū)。
　　1.反轉(zhuǎn)錄PCR分析mAChR亞型(M1R，M2R，M3R，M4R，M5R)，nAChR亞型(α2，α3，α4，α5，α6，α7，α9，α10，β2，β3，β4)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，CHAT)和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，A

6、ChE）的表達(dá):采用Trizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA的純度和濃度，瓊脂糖電泳觀察RNA的完整性。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在一定條件下PCR儀中擴(kuò)增，取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖電泳跑膠，用凝膠圖像分析儀拍照并分析電泳條帶;
　　2.Real-time PCR分析mAChR(M1R, M3R, M5R),nAChR(α5,α7)和AChE的表達(dá):取上一步驟中cDNA，在定量PCR儀中一定條件下擴(kuò)增

7、，運(yùn)用2-△△Ct法在MG組和正常對(duì)照組之間進(jìn)行相對(duì)定量比較;
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，應(yīng)用單因素方差分析和t檢驗(yàn)比較MG組和對(duì)照組NNCS表達(dá)的差異，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR分析MG組和對(duì)照組PBMC中M1R，M2R，M3R，M4R，M5R，α2,α3,α4,α5,α6,α7,α9,α10,β2,β3,β4, CHAT, AChE的表達(dá):MG患

8、者和對(duì)照組PBMC中均表達(dá)M1R，M3R，M5R，α5，α7，β2和AChE（均見(jiàn)明顯條帶），但是nAChR（α3，α9，β2）只在對(duì)照組中檢測(cè)到，其余各亞型和ChAT在兩組均未見(jiàn)表達(dá)（未見(jiàn)明顯條帶）。
　　2.Real-time PCR分析MG組和對(duì)照組PBMC中mAChR(M1R，M3R，M5R)，nAChR(α5，α7)和AChE的表達(dá):M1 mAChR表達(dá)量為對(duì)照組的0.8倍(p=0.418)，M3 mAChR為對(duì)照組的0

9、.4倍(p=0.004)，M5 mAChR為對(duì)照組的1.23倍(p=0.488)，α5 nAChR為對(duì)照組的0.63倍(p=0.177)，α7 nAChR為對(duì)照組的0.81倍(p=0.668)，AChE為對(duì)照組的3.24倍(p=0.002)，M3 mAChR表達(dá)顯著低于對(duì)照組，AChE表達(dá)表達(dá)顯著高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　MG患者PBMC中nAChR(α3，α9，β2)，M3 mAChR以及AChE表達(dá)存在差異，胸腺作為