血型D抗原模擬多肽隨機(jī)噬菌體庫篩選方案的建立及驗證.pdf

1、目的：
　　預(yù)測RhD蛋白抗原活性表位，探討隨機(jī)噬菌體十二肽庫篩選血型D抗原模擬多肽的影響因素，建立最佳篩選方案，得到RhD血型抗原的模擬表位。
　　方法：
　?、爬蒙镄畔⒓夹g(shù)預(yù)測RhD蛋白抗原活性表位。⑵對比洗脫時間分別為4、8、12、16和30分鐘的洗脫液滴度。⑶對比3輪清洗緩沖液中Tween20濃度分別為0.1％、0.2%、0.5%和分別為0.1%、0.5%、0.5%時每輪淘洗的投入/產(chǎn)出比和P/N值。⑷對比

2、3輪封閉緩沖液均為0.5% BSA和分別為0.5%BSA、1%明膠、5%脫脂奶時每輪淘洗的投入/產(chǎn)出比和P/N值。⑸分析篩選效果，得出最佳篩選方案。ELISA法檢測每輪淘洗后洗脫噬菌體的擴(kuò)增液與IgG型單克隆抗-D的結(jié)合力。⑹測定采用最佳篩選方案篩選所得陽性克隆 DNA序列和做抗體競爭抑制試驗、噬菌體凝集抑制試驗，檢測D抗原模擬表位。
　　結(jié)果：
　?、兕A(yù)測RhD蛋白的N端36-41、100-104、353-356區(qū)段為Rh

3、D蛋白抗原活性表位區(qū)域。②洗脫8分鐘時洗脫液滴度為（2.31±0.25）×106 pfu/mL，洗脫4、12、16和30分鐘時的洗脫液滴度與之相比明顯下降（P＜0.01）。③當(dāng)洗脫時間為8分鐘且3輪封閉緩沖液均為0.5%BSA時，3輪淘洗清洗緩沖液Tween20濃度分別為0.1%、0.5%、0.5%時投入/產(chǎn)出比分別為1.69×107、4.95×105、9.58×102，P/N值分別為1.39±0.04、2.54±0.13、3.02±0

4、.04；與清洗緩沖液Tween20濃度分別為0.1%、0.2%、0.5%時投入/產(chǎn)出比分別為2.70×107、4.57×105、1.14×103，P/N值分別為1.45±0.11、1.88±0.12、2.96±0.03相比，篩選效果影響不大。④當(dāng)洗脫時間為8分鐘且3輪淘洗清洗緩沖液Tween20濃度分別為0.1%、0.5%、0.5%時，3輪封閉緩沖液分別為0.5% BSA、1%明膠、5%脫脂奶時投入/產(chǎn)出比分別為1.93×107、6.4

5、4×103、6.23×101，P/N值分別為1.34±0.22、5.71±0.53、6.88±0.79，明顯優(yōu)于3輪淘洗封閉緩沖液均為0.5%BSA時的投入/產(chǎn)出比（分別為1.94×107、1.66×105、8.23×102）和P/N值（分別為1.32±0.11、2.64±0.34、3.40±0.66）。⑤隨著淘洗輪次增加，優(yōu)化的篩選方案（洗脫時間為8分鐘，3輪淘洗的清洗緩沖液Tween20濃度分別為0.1%、0.5%、0.5%和3輪淘

6、洗的封閉緩沖液分別為0.5% BSA、1%明膠、5%脫脂奶）每輪淘洗后洗脫噬菌體的擴(kuò)增液與 IgG型單克隆抗-D結(jié)合力逐漸增強(qiáng)。⑥篩選得到的噬菌體十二肽序列“VHWDFRQWWQPS”與 IgG型單克隆抗-D競爭抑制率約為50%；對IgG型單克隆抗-D與O型RhD陽性紅細(xì)胞的凝集具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　結(jié)論：
　?、爬蒙镄畔⒓夹g(shù)預(yù)測的3個RhD蛋白抗原活性表位可作為RhD蛋白潛在優(yōu)勢表位的參考。⑵洗脫