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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究以生物化學(xué)手段(酶反應(yīng)學(xué))和細(xì)胞及分子生物學(xué)手段側(cè)重研究了CYP2A13對(duì)AFB1的代謝活化能力及其功能,并與傳統(tǒng)的AFB1代謝酶CYP1A2進(jìn)行比較,研究結(jié)果證明了CYP2A13是一種全新的、高效的AFB1代謝酶,這不僅為AFB1可誘發(fā)人肺癌提供了機(jī)理上的有力證據(jù),而且為今后尋找CYP2A13特異性抑制劑并利用它們對(duì)AFB1所致肺癌進(jìn)行化學(xué)預(yù)防提供了理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下: 1.運(yùn)用Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞成功地在體外表達(dá)了人
2、CYP2A13蛋白,免疫印跡結(jié)果顯示,CYP2A13蛋白在約55kD附近顯示一條強(qiáng)帶,而對(duì)照蛋白(僅表達(dá)載體)則無(wú)此條帶;CYP2A13蛋白在波長(zhǎng)為450nm處顯示特征性的吸收峰。 2.體外酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示,CYP2A13代謝AFB1可生成包括具有毒性和致癌活性的環(huán)氧化物AFB1-epoxide和AFM1-epoxide在內(nèi)的多種代謝產(chǎn)物,而對(duì)照蛋白則沒(méi)有。與傳統(tǒng)的AFB1代謝酶CYP1A2相比,在15μM和150μMAFB
3、1濃度下,CYP2A13代謝AFB1生成的AFM1-epoxide與CYP1A2基本相當(dāng),AFB1-epoxide為CYP1A2的三分之一,CYP2A13尚代謝生成許多未知的代謝產(chǎn)物。雖然CYP2A6也被認(rèn)為是AFB1的代謝酶,但本研究結(jié)果顯示,在15μMAFB1濃度下,CYP2A6無(wú)代謝活性;即使在150μM濃度下,也未檢測(cè)到AFB1的環(huán)氧化代謝產(chǎn)物。 3.運(yùn)用Flp-In系統(tǒng)在CHO細(xì)胞成功地建立了穩(wěn)定表達(dá)CYP2A13蛋白
4、的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(CHO-2A13)。Flp-InCHO是一個(gè)經(jīng)過(guò)改造過(guò)的細(xì)胞株,由于在CHO染色體上植入了FRT位點(diǎn),運(yùn)用特殊的載體(pcDNA5/FRT)可以保證所轉(zhuǎn)染的cDNA僅以單拷貝的方式插入到染色體的固定位點(diǎn),避免了在一般的細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)通常存在的插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)的不確定性,從而保證了轉(zhuǎn)染不同的cDNA都具有相同的蛋白表達(dá)效率,為比較不同蛋白的代謝活性提供了可靠的保證。研究結(jié)果顯示,盡管CYP2A13和CYP2A6在CHO細(xì)胞中具有
5、相同的表達(dá)水平,但AFB1對(duì)兩者的細(xì)胞毒性(LC50)相差了1000倍(40nMvs40μM,48小時(shí));與CHO-CYP1A2相比,其細(xì)胞毒性也相差了近6倍(220nMvs1.2μM,24小時(shí)),而對(duì)CHO-CYP3A4的LC50至少為50μM。AFB1對(duì)CHO-CYP2A13的細(xì)胞毒性不僅具有劑量依賴(lài)性,而且呈時(shí)間依賴(lài)性。 4.通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的研究發(fā)現(xiàn),AFB1阻斷CHO-2A13細(xì)胞分裂(G2/Marrest)呈劑量依賴(lài)性
6、(24小時(shí)),而CYP1A2和CYP2A6僅在高劑量時(shí),G2/Marrest與對(duì)照相比具有顯著性;AFB1染毒48小時(shí),不僅CHO-2A13的細(xì)胞分裂受到破壞,其DNA合成(Sarrest)也受到明顯影響,而此刻僅CHO-1A2在高劑量時(shí)表現(xiàn)為G2/Marrest的升高。對(duì)細(xì)胞周期的影響可能與AFB1被CYP2A13代謝所形成的環(huán)氧化物與細(xì)胞DNA形成加合物并進(jìn)而導(dǎo)致的DNA損傷有關(guān)。 5.運(yùn)用三種典型的化合物進(jìn)一步觀察CYP2
7、A13代謝活化AFB1的方式。丙烯酰胺不能被CYP2A13代謝也不引起細(xì)胞毒性,尼古丁可被CYP2A13代謝但不能引起細(xì)胞毒性,NNK既可被CYP2A13代謝也可引起細(xì)胞毒性。讓這三種化合物分別與AFB1共同處理CHO-2A13觀察它們的細(xì)胞毒作用。結(jié)果顯示,丙烯酰胺對(duì)AFB1所致的細(xì)胞毒作用無(wú)任何影響;尼古丁可劑量依賴(lài)性的抑制AFB1的毒作用,在100μM時(shí)幾乎完全抑制了AFB1的毒作用,這可能與尼古丁和AFB1在CYP2A13上具有
8、共同的作用靶點(diǎn),兩者競(jìng)爭(zhēng)作用的結(jié)果;NNK對(duì)AFB1的影響在低劑量時(shí)更符合單獨(dú)作用或相加作用的方式,等效劑量(20﹪的細(xì)胞死亡率)的NNK和AFB1可引起約40﹪的細(xì)胞死亡,這也符合各自的細(xì)胞毒作用機(jī)理,即兩者都是通過(guò)引起DNA損傷而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒作用,當(dāng)然高劑量的聯(lián)合作用方式還需研究。 6.運(yùn)用pcDNA5/FRT/V5-HisTOPO載體直接構(gòu)建了CYP2A13質(zhì)粒,該質(zhì)粒的特點(diǎn)是在CYP2A13蛋白的C段帶有一段V5-His
9、的多肽。有趣的是該多肽大大降低了CYP2A13代謝活化AFB1的能力,這種作用也同樣表現(xiàn)在另外一種黃曲霉毒素AFG1上。雖然CYP2A5的代謝活化能力比CYP2A13強(qiáng),但V5-His多肽對(duì)其功能幾乎無(wú)影響。此外,AFB1的代謝產(chǎn)物之一AFM1也被用來(lái)比較對(duì)CHO-2A13的毒作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFM1的毒性遠(yuǎn)低于AFB1和AFG1,這是否意味著AFM1是AFB1的解毒性產(chǎn)物,相關(guān)研究有待進(jìn)一步開(kāi)展。 7.通過(guò)比較CYP2A6和CY
10、P2A13兩種蛋白的差異以及運(yùn)用計(jì)算機(jī)模型對(duì)其蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的分析,運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)人工構(gòu)建了兩種可能對(duì)CYP2A13的活性產(chǎn)生影響的突變體Val117和Arg372。Val117代謝AFB1產(chǎn)生的環(huán)氧化代謝產(chǎn)物比野生型的多,而Arg372則完全喪失了活性;細(xì)胞毒性也顯示了相似的結(jié)果,AFB1對(duì)CHO-Val117的毒作用比野生性強(qiáng)5倍左右,而在相同條件下對(duì)CHO-Arg372幾乎無(wú)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室過(guò)去研究的該兩種突變體對(duì)NNK的代
11、謝活性完全一致,進(jìn)一步證實(shí)了#¨7和#372兩個(gè)位點(diǎn)的突變對(duì)CYP2A13活性的影響。 8.制備了CYP2A13特異性抗體,并運(yùn)用體外表達(dá)的CYP2A5、CYP2A6、CYP2A13、CYP3A4蛋白以及大鼠肝臟微粒體蛋白對(duì)其特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2A13抗體僅與CYP2A13蛋白結(jié)合,與其他蛋白質(zhì)無(wú)作用;而CYP2A6抗體(可與CYP2A5和CYP2A13有交叉反應(yīng))則能與CYP2A5、CYP2A6、CYP2A13蛋
12、白結(jié)合,且肝臟微粒體蛋白也呈陽(yáng)性反應(yīng);研究結(jié)果充分顯示了CYP2A13抗體的特異性。此外,運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)了人正常呼吸道組織及嗅覺(jué)上皮細(xì)胞中CYP2A13的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP2A13在肺氣管和支氣管上皮有很強(qiáng)的表達(dá),而在肺泡中的表達(dá)則很弱,這與已報(bào)道的CYP2A13mRNA可在呼吸系統(tǒng)組織中被檢測(cè)到的結(jié)果完全一致,進(jìn)一步證明了CYP2A13蛋白在呼吸系統(tǒng)中的表達(dá);CYP2A13還在大腦嗅覺(jué)上皮細(xì)胞中高度表達(dá),這項(xiàng)結(jié)果將為研究煙草代
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