直接連接法制備攜尿激酶RGDS造影劑微泡靶向溶解在體血栓的實驗研究.pdf

1、目的：研究制備攜帶尿激酶（UK）及精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－絲氨酸（RGDS）肽段靶向溶栓超聲微泡造影劑的可行性，并評價其理化性質(zhì)及所攜帶尿激酶的活性。探討不同濃度的FeCl3和不同方法對制備兔股動脈內(nèi)閉塞性、以血小板為主的混合性血栓的影響因素，為溶栓研究提供穩(wěn)定、方便的血栓模型。探索與血栓特異性靶向結(jié)合的超聲微泡攜帶藥物溶解血栓的靶向性和有效性。
　　 方法：尿激酶和RGDS進(jìn)行熒光雙標(biāo)記，根據(jù)尿激酶/RGDS 1∶1、2∶1

2、和1∶2不同比例實驗分為三組，以聲諾維（SonoVue）為載體，通過直接連接法，制備親血栓同時攜帶溶栓藥物的超聲微泡造影劑，并檢測三組微泡大小、形態(tài)、熒光亮度，微泡與尿激酶及RGDS的結(jié)合率以及所攜帶尿激酶的活性。30只新西蘭大白兔總60條股動脈，分別予以不同濃度的Fecl3（＜10%FeCl3，10%FeCl3，＞10%FeCl3）、外敷法和內(nèi)注射法以及股動脈遠(yuǎn)端有無夾閉等影響因素將動物分為三組，觀察血栓形成情況，并對血管行HE染色和

3、免疫組化血管假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）染色。42只新西蘭大白兔單側(cè)股動脈制作富含血小板的混合性血栓，分成7組，每組6只：1）單純超聲照射組（US）；2）超聲照射+造影劑注射組（US+M）；3）單純尿激酶靜脈注射組（UK）；4）超聲照射+微泡造影劑+尿激酶靜脈注射組（US+M+UK）；5）超聲照射+RGDS微泡造影劑組（US+R）；6）RGDS微泡造影劑+尿激酶靜脈注射組（R+UK）；7）超聲照射

4、+RGDS微泡造影劑+尿激酶組（US+R+UK）。將 RGDS、微泡造影劑（SonoVue）和尿激酶通過直接聯(lián)合法，按1∶1∶1配制6ml的溶液。3ml在5min內(nèi)團(tuán)注，3ml在20min內(nèi)靜脈緩慢推注，超聲照射30min。120min后，通過超聲檢測、血流量測量和病理結(jié)果分析來對血栓的靶向性及溶栓效果進(jìn)行評價。血流量持續(xù)監(jiān)測120min后對血管的再通率和溶栓過程中血流頻譜特點進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：聲諾維、尿激酶及RGDS三者

5、可以穩(wěn)定結(jié)合，以尿激酶和RGDS呈1：1比例配制的最佳。配制的造影劑在熒光顯微鏡下觀察，洗滌前、后微泡表面均可發(fā)出綠色及橙紅色熒光；流式細(xì)胞儀定量檢測結(jié)果顯示，洗滌前、后尿激酶攜帶率分別為73.4±11.0%、72.3±9.4%，RGDS攜帶率分別為67.1±10.9%、64.6±10.2%；體外血栓溶解實驗證實所制備造影劑中尿激酶具有活性（P＜0.01），血栓溶解率為18.4±3.2%。外敷10%FeCl3形成閉塞性血栓優(yōu)于其他濃度（

6、P＜0.001），10%FeCl3外敷法形成血栓優(yōu)于內(nèi)注射法（P＜0.001），10%FeCl3外敷法聯(lián)合遠(yuǎn)端夾閉形成血栓優(yōu)于無夾閉的條件（P＜0.001）。在R+UK組和US+R+UK組，熒光顯微鏡下兔股動脈血栓部位同時顯示標(biāo)記RGDS的橙紅色熒光和標(biāo)記尿激酶的綠色熒光；UK、US、US+R、US+M組血流量＜基礎(chǔ)血流量15%，均未實現(xiàn)溶栓后血管再通；US+M+UK、R+UK組血流量在基礎(chǔ)血流量的15%～49%之間；US+R+UK組血

7、流量＞75%基礎(chǔ)血流量。120min后 US、UK、US+M、US+R及US+M+UK組均未實現(xiàn)再通（再通率＜15%），血流頻譜未出現(xiàn)變化為小、低幅雜波；R+UK組實現(xiàn)部分再通（再通率41.61%），US+R+UK完全再通（再通率85.81%），溶栓時血流頻譜出現(xiàn)持續(xù)高幅、雜亂的波（P＜0.001），在US+R+UK組出現(xiàn)超聲波與血流頻譜出現(xiàn)高幅、雜亂的共振變化血流量實現(xiàn)完全再通。
　　 結(jié)論：應(yīng)用直接連接法可以制備同時攜帶尿激