JAR細(xì)胞靶向微泡造影劑的體外作用研究.pdf

1、異位妊娠和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的疾病，早期診斷是提高療效，改善預(yù)后的關(guān)鍵。因此，早期定性、定位診斷胚胎著床點(diǎn)或滋養(yǎng)細(xì)胞集群位置成為婦產(chǎn)科工作者不懈追求的目標(biāo)。 自從1969年超聲造影劑概念的提出以來(lái)，超聲造影劑引起了超聲工作者的注意，在醫(yī)學(xué)超聲診斷及研究領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。但是這些研究都基于造影劑能使超聲顯像回聲增強(qiáng)基礎(chǔ)之上，無(wú)組織或器官特異性及選擇性。國(guó)內(nèi)資料顯示目前沒(méi)有見(jiàn)到造影劑在異位妊娠和滋養(yǎng)細(xì)胞疾病等方面的

2、研究報(bào)道。 隨著對(duì)超聲造影劑研究的不斷深入，研究人員正在探索用特異性配體連接到微泡造影劑表面稱(chēng)之為靶向超聲造影劑，這種靶向微泡對(duì)于病變靶組織病變有較好的親和力，使之達(dá)到靶向組織或器官，選擇性地與相應(yīng)的配體結(jié)合，從而特異性的增強(qiáng)靶組織超聲信號(hào)，實(shí)現(xiàn)早期探測(cè)細(xì)小病變甚至實(shí)現(xiàn)局部靶向治療的目標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備耦合抗HCG抗體的靶向微泡超聲造影劑，在體外進(jìn)行其對(duì)JAR細(xì)胞作用的研究，觀察靶向超聲造影劑對(duì)JAR細(xì)胞的結(jié)合能力，靶向結(jié)

3、合的穩(wěn)定性以及超聲下靶向微泡的敏感性，為今后的胚胎著床點(diǎn)定位研究及滋養(yǎng)細(xì)胞的定位定量研究，達(dá)到早期排除異位妊娠及滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的定位診斷，甚至為臨床藥物治療乃至局部靶向化療等提供科學(xué)依據(jù)。 材料與方法 1、細(xì)胞培養(yǎng)： 1.1JAR細(xì)胞的培養(yǎng)置于5％CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液一次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約占瓶底壁80％面積時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 1.2取子宮內(nèi)膜組織后用消化培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，分離得到的子宮

4、內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，置于5％CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至約占瓶底壁80％面積時(shí)，以0.25％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化傳代培養(yǎng)。 1.3子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的鑒定用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2、靶向超聲造影劑的制備參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行。將抗人HCG抗體與Sonovue微泡懸液按等體積混合，在4℃條件下反應(yīng)2h，PH值7.2～7.4之間，靜置分層后，取上層混懸液進(jìn)行鑒定。 3、靶向微泡造影劑的鑒定

5、 3.1玻片凝集實(shí)驗(yàn)取潔凈載玻片分別加上層混懸液及Sonovue各20μl，然后在載玻片上分別滴加等體積鼠抗兔IgG血清和等體積生理鹽水。不時(shí)輕輕搖動(dòng)，光鏡下觀察。 3.2免疫熒光實(shí)驗(yàn)取潔凈載玻片分別加上層混懸液和Sonovue各20μl，分別加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清，避光反應(yīng)15分鐘，在熒光顯微鏡下觀察。 3.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)取250ul上層混懸液和等體積FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清混合后，1000轉(zhuǎn)×

6、3min，PBS重懸后在流式細(xì)胞儀器上進(jìn)行檢測(cè)，用150μl上層混懸液和等體積PBS為對(duì)照組。 4、靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞的靶向結(jié)合實(shí)驗(yàn) 4.1花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)將生長(zhǎng)良好的JAR細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(2×105/ml)，取100μl上述細(xì)胞懸液分別加入靶向微泡造影劑或Sonovue微泡，室溫振蕩10min，光鏡下觀察細(xì)胞和微泡的結(jié)合情況，以結(jié)合5個(gè)微泡以上的細(xì)胞為陽(yáng)性，每張蓋玻片上觀察10個(gè)視野內(nèi)花環(huán)形成率，以子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)

7、胞為對(duì)照組。 4.2花環(huán)形成阻斷實(shí)驗(yàn)取出已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的JAR細(xì)胞爬片，用PBS液沖洗，洗去貼壁不牢的細(xì)胞及細(xì)胞碎片組織，分別加入20μl不同濃度(相對(duì)濃度100％、50％、25％)的抗HCG抗體，室溫下反應(yīng)20min后，用PBS液洗去未結(jié)合的抗HCG抗體，再加入靶向微泡造影劑20μl，室溫下反應(yīng)10min，用PBS液洗滌后計(jì)算花環(huán)形成率。 4.3靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞結(jié)合力的觀察取出已經(jīng)長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的載玻片共12張(其中

8、6張為JAR細(xì)胞，6張為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞)，PBS液沖洗之后，分別加入靶向微泡造影劑20μl，室溫下反應(yīng)10min，以0.6m/s的速度沖洗后，光鏡下計(jì)算靶向造影劑微泡與細(xì)胞的結(jié)合率。 4.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)制備JAR細(xì)胞懸液，加入靶向造影劑微泡及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清，1000轉(zhuǎn)×3min，PBS重懸后在流式細(xì)胞儀器上進(jìn)行檢測(cè)，以等體積細(xì)胞懸液加等體積靶向微泡造影劑和PBS為對(duì)照組。 5、靶向微泡造影劑的超聲下顯

9、影取500ml的生理鹽水一袋，去除內(nèi)部氣體。將20μl的靶向造影劑注射到生理鹽水中，高頻探頭(頻率13MHz)表面涂抹耦合劑緊貼輸液袋上進(jìn)行超聲掃描，空白輸液袋作為對(duì)照組。 結(jié)果 1、靶向微泡造影劑制成后的鑒定為了對(duì)用交聯(lián)法制備的靶向微泡造影劑進(jìn)行鑒定，進(jìn)行了玻片凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。當(dāng)加入鼠抗兔IgG血清后，光鏡下觀察原來(lái)均勻分布的靶向微泡造影劑形成輕度的凝集狀態(tài)，而加生理鹽水后仍是均勻分散的微氣

10、泡。Sonovue微泡加入鼠抗兔IgG血清或生理鹽水后均未見(jiàn)凝集反應(yīng)。靶向微泡造影劑經(jīng)FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清染色后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)靶向微泡表面發(fā)出明亮的熒光，而單純的Sonovue微泡則未見(jiàn)明顯熒光。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示Sonovue微泡與兔抗人HCG抗體的結(jié)合率為67.63％。均證明兔抗人HCG抗體已經(jīng)結(jié)合到了Sonovue微泡上。 2、靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞的靶向結(jié)合 2.1靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞懸浮液

11、混合反應(yīng)后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)多個(gè)靶向微泡造影劑結(jié)合在JAR細(xì)胞周?chē)?，形成花環(huán)。JAR細(xì)胞與靶向微泡造影劑的花環(huán)形成率74.00±5.66％，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與靶向微泡造影劑的花環(huán)形成率為11.00±1.58％(兩組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)；JAR細(xì)胞與Sonovue的花環(huán)形成率為1.60±1.14％，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與Sonovue的花環(huán)形成率為1.40±1.16％(兩組之間差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05)。 2.2當(dāng)

12、用25％、50％抗HCG抗體預(yù)處理JAR細(xì)胞之后，花環(huán)形成減少，花環(huán)形成率分別為64.40±3.21％和44.60±5.94％；當(dāng)用100％抗HCG抗體預(yù)處理JAR細(xì)胞之后，花環(huán)形成率為9.20±1.30％。 2.3當(dāng)靶向微泡造影劑與貼壁JAR細(xì)胞反應(yīng)后，鏡下觀察JAR細(xì)胞與靶向微泡造影劑的結(jié)合率為85.80±3.35％。用0.6m/s的恒速PBS緩沖液沖洗后，結(jié)合率為82.40±3.97％。沖洗前后靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞的

13、結(jié)合率差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與靶向微泡造影劑沖洗前后的結(jié)合率分別為5.00±3.53％和3.00±3.16％，差別也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.4流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：JAR細(xì)胞與靶向微泡造影劑的結(jié)合率為81.03％。 3、靶向微泡造影劑的超聲下顯影在實(shí)驗(yàn)組，在注入靶向微泡造影劑0時(shí)，靶向微泡造影劑在超聲儀顯示屏幕上顯示成條帶狀光點(diǎn)回聲反射。5～10分鐘之后，靶向微泡造影劑均

14、勻彌散，掃描時(shí)可見(jiàn)超聲屏幕上出現(xiàn)密集的光點(diǎn)回聲，每個(gè)反射回聲直徑1～3mm。從1小時(shí)開(kāi)始每隔1小時(shí)抽出1ml計(jì)數(shù)，得出微泡濃度為分別為：192.67±6.36個(gè)/ml，185.00±2.88個(gè)/ml，180.00±5.77個(gè)/ml，173.33±14.53個(gè)/ml，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這段時(shí)間內(nèi)在超聲儀顯示屏幕上仍表現(xiàn)為密集的光點(diǎn)回聲。從第4小時(shí)開(kāi)始每10分鐘計(jì)數(shù)一次直至超聲儀屏幕上光點(diǎn)消失，得到的微泡濃度分別為103.

15、00±8.81個(gè)/ml，36.00±2.31個(gè)/ml，4.00±2.08個(gè)/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論 1、本研究中所制備的靶向微泡造影劑在體外可以與JAR細(xì)胞特異性結(jié)合，與對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞之間存在顯著性差異，且隨著JAR細(xì)胞數(shù)目的不斷減少，花環(huán)形成率也隨之降低； 2、靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞特異性結(jié)合力在一定時(shí)間內(nèi)具有一定的強(qiáng)度，可以抵抗毛細(xì)血管內(nèi)血流的生理性沖洗的破壞；