JAR細(xì)胞靶向微泡造影劑的體外作用研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、異位妊娠和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的疾病,早期診斷是提高療效,改善預(yù)后的關(guān)鍵。因此,早期定性、定位診斷胚胎著床點(diǎn)或滋養(yǎng)細(xì)胞集群位置成為婦產(chǎn)科工作者不懈追求的目標(biāo)。 自從1969年超聲造影劑概念的提出以來(lái),超聲造影劑引起了超聲工作者的注意,在醫(yī)學(xué)超聲診斷及研究領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。但是這些研究都基于造影劑能使超聲顯像回聲增強(qiáng)基礎(chǔ)之上,無(wú)組織或器官特異性及選擇性。國(guó)內(nèi)資料顯示目前沒(méi)有見(jiàn)到造影劑在異位妊娠和滋養(yǎng)細(xì)胞疾病等方面的

2、研究報(bào)道。 隨著對(duì)超聲造影劑研究的不斷深入,研究人員正在探索用特異性配體連接到微泡造影劑表面稱(chēng)之為靶向超聲造影劑,這種靶向微泡對(duì)于病變靶組織病變有較好的親和力,使之達(dá)到靶向組織或器官,選擇性地與相應(yīng)的配體結(jié)合,從而特異性的增強(qiáng)靶組織超聲信號(hào),實(shí)現(xiàn)早期探測(cè)細(xì)小病變甚至實(shí)現(xiàn)局部靶向治療的目標(biāo)。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備耦合抗HCG抗體的靶向微泡超聲造影劑,在體外進(jìn)行其對(duì)JAR細(xì)胞作用的研究,觀察靶向超聲造影劑對(duì)JAR細(xì)胞的結(jié)合能力,靶向結(jié)

3、合的穩(wěn)定性以及超聲下靶向微泡的敏感性,為今后的胚胎著床點(diǎn)定位研究及滋養(yǎng)細(xì)胞的定位定量研究,達(dá)到早期排除異位妊娠及滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的定位診斷,甚至為臨床藥物治療乃至局部靶向化療等提供科學(xué)依據(jù)。 材料與方法 1、細(xì)胞培養(yǎng): 1.1JAR細(xì)胞的培養(yǎng)置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液一次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約占瓶底壁80%面積時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 1.2取子宮內(nèi)膜組織后用消化培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng),分離得到的子宮

4、內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至約占瓶底壁80%面積時(shí),以0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化傳代培養(yǎng)。 1.3子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的鑒定用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2、靶向超聲造影劑的制備參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行。將抗人HCG抗體與Sonovue微泡懸液按等體積混合,在4℃條件下反應(yīng)2h,PH值7.2~7.4之間,靜置分層后,取上層混懸液進(jìn)行鑒定。 3、靶向微泡造影劑的鑒定

5、 3.1玻片凝集實(shí)驗(yàn)取潔凈載玻片分別加上層混懸液及Sonovue各20μl,然后在載玻片上分別滴加等體積鼠抗兔IgG血清和等體積生理鹽水。不時(shí)輕輕搖動(dòng),光鏡下觀察。 3.2免疫熒光實(shí)驗(yàn)取潔凈載玻片分別加上層混懸液和Sonovue各20μl,分別加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清,避光反應(yīng)15分鐘,在熒光顯微鏡下觀察。 3.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)取250ul上層混懸液和等體積FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清混合后,1000轉(zhuǎn)×

6、3min,PBS重懸后在流式細(xì)胞儀器上進(jìn)行檢測(cè),用150μl上層混懸液和等體積PBS為對(duì)照組。 4、靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞的靶向結(jié)合實(shí)驗(yàn) 4.1花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)將生長(zhǎng)良好的JAR細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(2×105/ml),取100μl上述細(xì)胞懸液分別加入靶向微泡造影劑或Sonovue微泡,室溫振蕩10min,光鏡下觀察細(xì)胞和微泡的結(jié)合情況,以結(jié)合5個(gè)微泡以上的細(xì)胞為陽(yáng)性,每張蓋玻片上觀察10個(gè)視野內(nèi)花環(huán)形成率,以子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)

7、胞為對(duì)照組。 4.2花環(huán)形成阻斷實(shí)驗(yàn)取出已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)的JAR細(xì)胞爬片,用PBS液沖洗,洗去貼壁不牢的細(xì)胞及細(xì)胞碎片組織,分別加入20μl不同濃度(相對(duì)濃度100%、50%、25%)的抗HCG抗體,室溫下反應(yīng)20min后,用PBS液洗去未結(jié)合的抗HCG抗體,再加入靶向微泡造影劑20μl,室溫下反應(yīng)10min,用PBS液洗滌后計(jì)算花環(huán)形成率。 4.3靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞結(jié)合力的觀察取出已經(jīng)長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的載玻片共12張(其中

8、6張為JAR細(xì)胞,6張為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞),PBS液沖洗之后,分別加入靶向微泡造影劑20μl,室溫下反應(yīng)10min,以0.6m/s的速度沖洗后,光鏡下計(jì)算靶向造影劑微泡與細(xì)胞的結(jié)合率。 4.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)制備JAR細(xì)胞懸液,加入靶向造影劑微泡及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清,1000轉(zhuǎn)×3min,PBS重懸后在流式細(xì)胞儀器上進(jìn)行檢測(cè),以等體積細(xì)胞懸液加等體積靶向微泡造影劑和PBS為對(duì)照組。 5、靶向微泡造影劑的超聲下顯

9、影取500ml的生理鹽水一袋,去除內(nèi)部氣體。將20μl的靶向造影劑注射到生理鹽水中,高頻探頭(頻率13MHz)表面涂抹耦合劑緊貼輸液袋上進(jìn)行超聲掃描,空白輸液袋作為對(duì)照組。 結(jié)果 1、靶向微泡造影劑制成后的鑒定為了對(duì)用交聯(lián)法制備的靶向微泡造影劑進(jìn)行鑒定,進(jìn)行了玻片凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。當(dāng)加入鼠抗兔IgG血清后,光鏡下觀察原來(lái)均勻分布的靶向微泡造影劑形成輕度的凝集狀態(tài),而加生理鹽水后仍是均勻分散的微氣

10、泡。Sonovue微泡加入鼠抗兔IgG血清或生理鹽水后均未見(jiàn)凝集反應(yīng)。靶向微泡造影劑經(jīng)FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG血清染色后,熒光顯微鏡下可見(jiàn)靶向微泡表面發(fā)出明亮的熒光,而單純的Sonovue微泡則未見(jiàn)明顯熒光。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示Sonovue微泡與兔抗人HCG抗體的結(jié)合率為67.63%。均證明兔抗人HCG抗體已經(jīng)結(jié)合到了Sonovue微泡上。 2、靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞的靶向結(jié)合 2.1靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞懸浮液

11、混合反應(yīng)后,顯微鏡下觀察可見(jiàn)多個(gè)靶向微泡造影劑結(jié)合在JAR細(xì)胞周?chē)?,形成花環(huán)。JAR細(xì)胞與靶向微泡造影劑的花環(huán)形成率74.00±5.66%,子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與靶向微泡造影劑的花環(huán)形成率為11.00±1.58%(兩組之間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05);JAR細(xì)胞與Sonovue的花環(huán)形成率為1.60±1.14%,子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與Sonovue的花環(huán)形成率為1.40±1.16%(兩組之間差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05)。 2.2當(dāng)

12、用25%、50%抗HCG抗體預(yù)處理JAR細(xì)胞之后,花環(huán)形成減少,花環(huán)形成率分別為64.40±3.21%和44.60±5.94%;當(dāng)用100%抗HCG抗體預(yù)處理JAR細(xì)胞之后,花環(huán)形成率為9.20±1.30%。 2.3當(dāng)靶向微泡造影劑與貼壁JAR細(xì)胞反應(yīng)后,鏡下觀察JAR細(xì)胞與靶向微泡造影劑的結(jié)合率為85.80±3.35%。用0.6m/s的恒速PBS緩沖液沖洗后,結(jié)合率為82.40±3.97%。沖洗前后靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞的

13、結(jié)合率差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與靶向微泡造影劑沖洗前后的結(jié)合率分別為5.00±3.53%和3.00±3.16%,差別也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2.4流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示:JAR細(xì)胞與靶向微泡造影劑的結(jié)合率為81.03%。 3、靶向微泡造影劑的超聲下顯影在實(shí)驗(yàn)組,在注入靶向微泡造影劑0時(shí),靶向微泡造影劑在超聲儀顯示屏幕上顯示成條帶狀光點(diǎn)回聲反射。5~10分鐘之后,靶向微泡造影劑均

14、勻彌散,掃描時(shí)可見(jiàn)超聲屏幕上出現(xiàn)密集的光點(diǎn)回聲,每個(gè)反射回聲直徑1~3mm。從1小時(shí)開(kāi)始每隔1小時(shí)抽出1ml計(jì)數(shù),得出微泡濃度為分別為:192.67±6.36個(gè)/ml,185.00±2.88個(gè)/ml,180.00±5.77個(gè)/ml,173.33±14.53個(gè)/ml,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這段時(shí)間內(nèi)在超聲儀顯示屏幕上仍表現(xiàn)為密集的光點(diǎn)回聲。從第4小時(shí)開(kāi)始每10分鐘計(jì)數(shù)一次直至超聲儀屏幕上光點(diǎn)消失,得到的微泡濃度分別為103.

15、00±8.81個(gè)/ml,36.00±2.31個(gè)/ml,4.00±2.08個(gè)/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 1、本研究中所制備的靶向微泡造影劑在體外可以與JAR細(xì)胞特異性結(jié)合,與對(duì)照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞之間存在顯著性差異,且隨著JAR細(xì)胞數(shù)目的不斷減少,花環(huán)形成率也隨之降低; 2、靶向微泡造影劑與JAR細(xì)胞特異性結(jié)合力在一定時(shí)間內(nèi)具有一定的強(qiáng)度,可以抵抗毛細(xì)血管內(nèi)血流的生理性沖洗的破壞;

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