JAR細胞靶向微泡造影劑的體外作用研究.pdf

1、異位妊娠和妊娠滋養(yǎng)細胞疾病是婦產(chǎn)科常見的疾病，早期診斷是提高療效，改善預(yù)后的關(guān)鍵。因此，早期定性、定位診斷胚胎著床點或滋養(yǎng)細胞集群位置成為婦產(chǎn)科工作者不懈追求的目標。 自從1969年超聲造影劑概念的提出以來，超聲造影劑引起了超聲工作者的注意，在醫(yī)學(xué)超聲診斷及研究領(lǐng)域得到了越來越多的應(yīng)用。但是這些研究都基于造影劑能使超聲顯像回聲增強基礎(chǔ)之上，無組織或器官特異性及選擇性。國內(nèi)資料顯示目前沒有見到造影劑在異位妊娠和滋養(yǎng)細胞疾病等方面的

2、研究報道。 隨著對超聲造影劑研究的不斷深入，研究人員正在探索用特異性配體連接到微泡造影劑表面稱之為靶向超聲造影劑，這種靶向微泡對于病變靶組織病變有較好的親和力，使之達到靶向組織或器官，選擇性地與相應(yīng)的配體結(jié)合，從而特異性的增強靶組織超聲信號，實現(xiàn)早期探測細小病變甚至實現(xiàn)局部靶向治療的目標。因此，本實驗通過制備耦合抗HCG抗體的靶向微泡超聲造影劑，在體外進行其對JAR細胞作用的研究，觀察靶向超聲造影劑對JAR細胞的結(jié)合能力，靶向結(jié)

3、合的穩(wěn)定性以及超聲下靶向微泡的敏感性，為今后的胚胎著床點定位研究及滋養(yǎng)細胞的定位定量研究，達到早期排除異位妊娠及滋養(yǎng)細胞腫瘤的定位診斷，甚至為臨床藥物治療乃至局部靶向化療等提供科學(xué)依據(jù)。 材料與方法 1、細胞培養(yǎng)： 1.1JAR細胞的培養(yǎng)置于5％CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液一次。當細胞生長至約占瓶底壁80％面積時進行傳代培養(yǎng)。 1.2取子宮內(nèi)膜組織后用消化培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)，分離得到的子宮

4、內(nèi)膜間質(zhì)細胞，置于5％CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至約占瓶底壁80％面積時，以0.25％胰蛋白酶加0.02％EDTA消化傳代培養(yǎng)。 1.3子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的鑒定用免疫組織化學(xué)方法進行細胞鑒定。 2、靶向超聲造影劑的制備參考文獻方法進行。將抗人HCG抗體與Sonovue微泡懸液按等體積混合，在4℃條件下反應(yīng)2h，PH值7.2～7.4之間，靜置分層后，取上層混懸液進行鑒定。 3、靶向微泡造影劑的鑒定

5、 3.1玻片凝集實驗取潔凈載玻片分別加上層混懸液及Sonovue各20μl，然后在載玻片上分別滴加等體積鼠抗兔IgG血清和等體積生理鹽水。不時輕輕搖動，光鏡下觀察。 3.2免疫熒光實驗取潔凈載玻片分別加上層混懸液和Sonovue各20μl，分別加入FITC標記的羊抗兔IgG血清，避光反應(yīng)15分鐘，在熒光顯微鏡下觀察。 3.3流式細胞儀檢測取250ul上層混懸液和等體積FITC標記的羊抗兔IgG血清混合后，1000轉(zhuǎn)×

6、3min，PBS重懸后在流式細胞儀器上進行檢測，用150μl上層混懸液和等體積PBS為對照組。 4、靶向微泡造影劑與JAR細胞的靶向結(jié)合實驗 4.1花環(huán)形成實驗將生長良好的JAR細胞制成細胞懸液(2×105/ml)，取100μl上述細胞懸液分別加入靶向微泡造影劑或Sonovue微泡，室溫振蕩10min，光鏡下觀察細胞和微泡的結(jié)合情況，以結(jié)合5個微泡以上的細胞為陽性，每張蓋玻片上觀察10個視野內(nèi)花環(huán)形成率，以子宮內(nèi)膜間質(zhì)細

7、胞為對照組。 4.2花環(huán)形成阻斷實驗取出已經(jīng)貼壁生長的JAR細胞爬片，用PBS液沖洗，洗去貼壁不牢的細胞及細胞碎片組織，分別加入20μl不同濃度(相對濃度100％、50％、25％)的抗HCG抗體，室溫下反應(yīng)20min后，用PBS液洗去未結(jié)合的抗HCG抗體，再加入靶向微泡造影劑20μl，室溫下反應(yīng)10min，用PBS液洗滌后計算花環(huán)形成率。 4.3靶向微泡造影劑與JAR細胞結(jié)合力的觀察取出已經(jīng)長滿細胞的載玻片共12張(其中

8、6張為JAR細胞，6張為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞)，PBS液沖洗之后，分別加入靶向微泡造影劑20μl，室溫下反應(yīng)10min，以0.6m/s的速度沖洗后，光鏡下計算靶向造影劑微泡與細胞的結(jié)合率。 4.4流式細胞儀檢測制備JAR細胞懸液，加入靶向造影劑微泡及FITC標記的羊抗兔IgG血清，1000轉(zhuǎn)×3min，PBS重懸后在流式細胞儀器上進行檢測，以等體積細胞懸液加等體積靶向微泡造影劑和PBS為對照組。 5、靶向微泡造影劑的超聲下顯

9、影取500ml的生理鹽水一袋，去除內(nèi)部氣體。將20μl的靶向造影劑注射到生理鹽水中，高頻探頭(頻率13MHz)表面涂抹耦合劑緊貼輸液袋上進行超聲掃描，空白輸液袋作為對照組。 結(jié)果 1、靶向微泡造影劑制成后的鑒定為了對用交聯(lián)法制備的靶向微泡造影劑進行鑒定，進行了玻片凝集實驗、免疫熒光染色實驗及流式細胞儀檢測。當加入鼠抗兔IgG血清后，光鏡下觀察原來均勻分布的靶向微泡造影劑形成輕度的凝集狀態(tài)，而加生理鹽水后仍是均勻分散的微氣

10、泡。Sonovue微泡加入鼠抗兔IgG血清或生理鹽水后均未見凝集反應(yīng)。靶向微泡造影劑經(jīng)FITC標記的羊抗兔IgG血清染色后，熒光顯微鏡下可見靶向微泡表面發(fā)出明亮的熒光，而單純的Sonovue微泡則未見明顯熒光。流式細胞檢測顯示Sonovue微泡與兔抗人HCG抗體的結(jié)合率為67.63％。均證明兔抗人HCG抗體已經(jīng)結(jié)合到了Sonovue微泡上。 2、靶向微泡造影劑與JAR細胞的靶向結(jié)合 2.1靶向微泡造影劑與JAR細胞懸浮液

11、混合反應(yīng)后，顯微鏡下觀察可見多個靶向微泡造影劑結(jié)合在JAR細胞周圍，形成花環(huán)。JAR細胞與靶向微泡造影劑的花環(huán)形成率74.00±5.66％，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與靶向微泡造影劑的花環(huán)形成率為11.00±1.58％(兩組之間差別有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05)；JAR細胞與Sonovue的花環(huán)形成率為1.60±1.14％，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與Sonovue的花環(huán)形成率為1.40±1.16％(兩組之間差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05)。 2.2當

12、用25％、50％抗HCG抗體預(yù)處理JAR細胞之后，花環(huán)形成減少，花環(huán)形成率分別為64.40±3.21％和44.60±5.94％；當用100％抗HCG抗體預(yù)處理JAR細胞之后，花環(huán)形成率為9.20±1.30％。 2.3當靶向微泡造影劑與貼壁JAR細胞反應(yīng)后，鏡下觀察JAR細胞與靶向微泡造影劑的結(jié)合率為85.80±3.35％。用0.6m/s的恒速PBS緩沖液沖洗后，結(jié)合率為82.40±3.97％。沖洗前后靶向微泡造影劑與JAR細胞的

13、結(jié)合率差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。對照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與靶向微泡造影劑沖洗前后的結(jié)合率分別為5.00±3.53％和3.00±3.16％，差別也沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 2.4流式細胞檢測結(jié)果顯示：JAR細胞與靶向微泡造影劑的結(jié)合率為81.03％。 3、靶向微泡造影劑的超聲下顯影在實驗組，在注入靶向微泡造影劑0時，靶向微泡造影劑在超聲儀顯示屏幕上顯示成條帶狀光點回聲反射。5～10分鐘之后，靶向微泡造影劑均

14、勻彌散，掃描時可見超聲屏幕上出現(xiàn)密集的光點回聲，每個反射回聲直徑1～3mm。從1小時開始每隔1小時抽出1ml計數(shù)，得出微泡濃度為分別為：192.67±6.36個/ml，185.00±2.88個/ml，180.00±5.77個/ml，173.33±14.53個/ml，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這段時間內(nèi)在超聲儀顯示屏幕上仍表現(xiàn)為密集的光點回聲。從第4小時開始每10分鐘計數(shù)一次直至超聲儀屏幕上光點消失，得到的微泡濃度分別為103.

15、00±8.81個/ml，36.00±2.31個/ml，4.00±2.08個/ml，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論 1、本研究中所制備的靶向微泡造影劑在體外可以與JAR細胞特異性結(jié)合，與對照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞之間存在顯著性差異，且隨著JAR細胞數(shù)目的不斷減少，花環(huán)形成率也隨之降低； 2、靶向微泡造影劑與JAR細胞特異性結(jié)合力在一定時間內(nèi)具有一定的強度，可以抵抗毛細血管內(nèi)血流的生理性沖洗的破壞；